中國白酒技術創(chuàng)新戰(zhàn)略發(fā)展委員會第四期科研項目報告（2021年-2023年度）

課題名稱：大曲微生態(tài)演替規(guī)律及形成機制研究

完成單位：中國科學院成都生物研究所

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立項背景

白酒是中國特色的傳統(tǒng)發(fā)酵飲品，多菌自然發(fā)酵的制酒工藝和蒸餾技術有著獨特的技藝和高超的水平。白酒中除了水之外的成分中包括約98%的乙醇和約2%的微量呈香呈味物質,，其中2%微量成份的種類和數量決定了白酒的風味和品質,。白酒釀造中，微量成份來源于微生物消耗原料所產生的代謝產物，微生物產生的蛋白水解酶、淀粉水解酶、酯化酶,、脫酸酶、脫氨酶等復雜酶系,，對原料中的淀粉,、多糖、單糖,、蛋白質,、氨基酸、核酸等基質,，接力或平行進行降解,、合成、轉化等各種復雜的生物,、化學反應,，使原料發(fā)生復雜的變化，形成醇,、醛,、酸、酯,、酮等微量成份,，不同的微生物產生不同種類和數量的酶，從而形成不同的微量成份,。因此,，微生物的種類和數量對白酒的風味與品質具有重要的影響,。

大曲是白酒釀造微生物的主要來源，以曲藥為微生物載體的多菌種混合發(fā)酵生產工藝是中國白酒區(qū)別于世界其它蒸餾酒的主要特征之一,。大曲微生物對糖化,、發(fā)酵和香味物質的產生發(fā)揮著重要作用，是白酒生產不可缺少的關鍵部分,，“曲乃酒之骨”足以說明酒曲在中國白酒生產中起到了十分重要的作用,。

大曲是由其中的微生物及其微環(huán)境組成的一個微生態(tài)系統(tǒng),，微生物種類和數量的演替對這個系統(tǒng)的形成有著重要的作用,。大曲制作以小麥為主要原料，發(fā)酵初期,，大曲中的微生物數量極少,，主要以孢子，單個菌體的形式存在,，隨著發(fā)酵的進行,，不同微生物由于生長繁殖速度不同，而導致數量存在差異,，調節(jié)溫度,、酸度、水分等大曲微環(huán)境發(fā)生變化,，隨著大曲微環(huán)境的變化,，某些微生物菌株逐步停止生長，甚至死亡,，其它的一些菌株開始生長繁殖,，最后實現水分、酸度,、酶活性和微生物群落的空間平衡,，從而形成穩(wěn)定的大曲微生態(tài)系統(tǒng)。

早期大曲微生物演替規(guī)律研究主要采用平皿計數法,，通過將大曲樣品適當稀釋后在一定的培養(yǎng)基上培養(yǎng),，形成單菌落后計數。這種方法測定活菌數,，可以消除掉已經死亡的菌株干擾,，但缺點是只能計數細菌、霉菌,、酵母,、乳酸菌等微生物的數量，僅能比較概略地了解幾大微生物類群大概的變化趨勢,，不能確定真正參與大曲發(fā)酵過程的功能微生物的種屬,。近年分子生物學技術的發(fā)展尤其高通量測序成本的降低為大曲微生物的演替研究提供了新的技術手段,，促進了對大曲制作過程微生物演替規(guī)律的認識，然而該方法同樣存在明顯的缺點,，由于受大曲中微生物分布不均一,、從大曲復雜成分中提取總DNA提取效率低、測序結果數據處理方法等因素的影響,，導致高通量測序的結果重復性差,。同時，高通量測序也只能反應大曲微生物群落組成情況,，無法反應群落動態(tài)演替過程以及微生物之間的相互關系,，并且無法消除死亡微生物的影響，不能如實的反映大曲制作過程微生物種類和數量的變化,，不能真正確定具體微生物菌種在大曲制作過程中的演替規(guī)律,。然而，準確定量地分析大曲中主要微生物的生長繁殖過程,，闡明大曲微生態(tài)系統(tǒng)的演替規(guī)律及形成機制,，闡明大曲培養(yǎng)功能微生物，有利于大曲生產過程工藝參數優(yōu)化,，促進大曲機械化,、智能化生產。

本項目擬選擇優(yōu)質中高溫大曲為研究對象,，開展以下研究內容：

（一）采用三代測序技術分析中高溫大曲制作關鍵工序微生物種分類水平上的種類,。以此為指導，設計針對性的分離培養(yǎng)策略,，針對性分離中高溫大曲中的優(yōu)勢功能微生物并研究其在種水平上的分類學地位,，建立中高溫大曲微生物菌種資源庫。

（二）針對不同微生物特有基因序列,，設計專一引物,，結合qPCR技術對大曲制作關鍵工序中不同微生物菌種的菌數進行定量分析，確定不同微生物菌種在大曲發(fā)酵過程中的生長,、繁殖及消亡過程,，全面分析微生物在大曲微生態(tài)形成過程中的演替規(guī)律，確定不同微生物菌種在大曲制作過程中的角色--功能菌（參與大曲發(fā)酵）和非功能菌（僅存在但不參與大曲發(fā)酵）,，進而確定中高溫大曲的關鍵功能微生物,。

（三）利用共培養(yǎng)技術手段剖析不同功能菌種之間的生物學互作關系，利用硅膠柱層析,、高效液相色譜（HPLC）,、高效液相色譜質譜聯(lián)用（HPLC-MS）等色譜分離技術和核磁共振（NMR）、高分辨質譜（HRMS）、紅外（IR）,、紫外（UV）色譜波譜等現代分析化學技術手段,，研究闡明優(yōu)勢菌化學生態(tài)學作用的物質基礎；（四）分析功能菌代謝產物在大曲培養(yǎng)過程中的生成,、累積和分解過程,，闡明功能菌在微生態(tài)系統(tǒng)演替過程中的化學生態(tài)學作用機制。

目前,，我們主要對中高溫大曲的微生物群落組成進行了分析,，分離純化了部分關鍵菌株，并對部分菌株的代謝產物進行了初步分析,。

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主要研究內容

2.1 中高溫大曲微生物菌種資源庫的建立

采用三代測序技術分析中高溫大曲制作關鍵工序的細菌和真菌群落結構,，以測序結果為指導，針對菌種的生物學特性,，設計特定的菌種分離培養(yǎng)策略,，建立關鍵菌株可培養(yǎng)分離技術,、特色菌株篩選模型,，分離中高溫大曲制作不同階段微生物菌種，通過分子生物學技術并結合形態(tài)生理特征研究菌株在種水平上的分類學地位,，建立中高溫大曲微生物菌種資源庫,。

2.1.1 微生物群落結構分析

大曲培制是多菌種自然發(fā)酵過程，微生物種類復雜,，數量眾多,，解析其微生物種群的組成及變化規(guī)律，對于釀造微生物的分離及功能解析具有積極的指導作用,。高通量測序技術可以深入研究環(huán)境樣品中微生物的群落組成和功能菌株,，本研究選取兩個地區(qū)中高溫大曲制作不同階段樣品，應用改良的CTAB法提取樣品總 DNA 后,，基于 PacBio 測序平臺,，利用單分子實時測序（SMRT Cell）的方法對 marker 基因進行測序，之后通過對 CCS（Circular Consensus Sequencing）,，分析樣品的物種構成,。

2.1.2 釀造微生物菌株分離

白酒釀造研究中，微生物純菌種的獲得非常重要,。雖然分子生物學技術可發(fā)現微生物物種,、遺傳、代謝等方面豐富的多樣性,， 但是單純運用分子生物學技術對復雜體系中特異微生物群體進行生理學和代謝分析還存在很大的難度,。尤其是研究微生物功能、微生物互作關系,、發(fā)酵機理等更需在純菌種基礎上進行,。我們基于高通量測序分析的樣品物種構成并結合大曲在白酒生產中的作用構建釀造微生物菌株的分離篩選模型,，主要構建了產生蛋白酶、淀粉酶,、纖維素酶,、脂肪酶、單寧酶,、乙醇等菌株的分離篩選模型,。針對一些釀造中豐度較高、常規(guī)方法不易分離或以往研究較少的微生物菌種如高溫放線菌,、鏈霉菌,、嗜熱真菌、乳酸菌等,，通過培養(yǎng)基成分設計,、培養(yǎng)溫度控制及培養(yǎng)時間變化等方法，建立微生物菌株分離篩選模型,，主要示例如下：

2.1.2.1 芽孢桿菌的分離

雖然高通量測序反映芽孢桿菌相對豐度并不是特別高,，但實踐表明芽孢桿菌在白酒釀造中是重要的微生物菌種。芽孢桿菌因為要產生芽孢,，耐熱性能較好,，因此在分離時先將樣品于80℃水浴10 min，再進行涂布稀釋分離,。

2.1.2.2 乳酸菌的分離

微生物群落結構分析的結果表明乳酸菌是大曲制作起始階段的主要類群,，因為怕乳酸乙酯過高，乳酸菌在白酒釀造中通常被認為是有害菌,，需要抑制其生長,。而乳酸菌在其它的發(fā)酵食品如酸奶、奶酪,、泡菜,、豆瓣等及人體益生菌中均是主要的功能菌，乳酸菌代謝的乳酸是發(fā)酵食品中的重要風味成分,，白酒中的適量的乳酸對白酒的風味也有積極的貢獻,，能夠掩蓋酒精的味道，從而降低白酒的刺激感,，增加酒體的綿柔度,，并且能有效地緩解酒中的酯類水解，促進酒體的穩(wěn)定,。乳酸與發(fā)酵環(huán)境中其它物質反應生成的乳酸乙酯香味弱,，味微甜，可增加酒體的醇甜感和醇厚度，延長酒體的后味,，較高含量的乳酸乙酯是中國白酒區(qū)別于國外蒸餾酒的顯著特征,。乳酸菌產生的乳酸還可維持酸性的釀造環(huán)境，有效地抑制部分雜菌的代謝活動,，改善釀造生產的微生態(tài)環(huán)境,。

無論是抑制或是利用，純菌種的獲得都是必要的,。乳酸菌耐酸,、耐缺氧環(huán)境，因此在分離乳酸菌時在平皿上涂布少量乳酸以降低培養(yǎng)基的pH值,，并且培養(yǎng)時將培養(yǎng)罐抽真空0.09 MPa,。

2.1.2.3 酵母菌的分離

酵母菌是白酒自然發(fā)酵中的重要微生物，其代謝產物是呈味和呈香物質的主要組分,。酵母菌可代謝乙醇,、乙酸、乙酸乙酯等,，乙酸乙酯及乙醇參與形成的乳酸乙酯,、己酸乙酯等是白酒的骨架風味成分。高通量測序的結果表明酵母菌是大曲發(fā)酵初始階段的主要菌群,，酵母菌的繁殖可形成低氧,、微酸環(huán)境，加上乙醇的作用,，可抑制雜菌，從而凈化釀造的微生態(tài)環(huán)境,。酵母菌分離相對容易,，通常酵母菌的分離采用麩皮汁瓊脂和麥芽汁瓊脂，為了增加分離到的酵母菌種類,，我們還采用了PDA,、IPS2、YPD,、豆芽汁等多種培養(yǎng)基,。

2.1.2.4 紅曲霉的分離

紅曲霉發(fā)酵產物紅曲是食療兩用的傳統(tǒng)中藥材，在食品及中藥上的應用已逾千年,。最早被用于釀造黃酒,，后來在制造腐乳、食醋,、食用色素及中藥上均有廣泛應用,。紅曲霉嗜酸，特別喜乳酸，耐高溫,，耐乙醇,，耐缺氧，能產生蛋白酶,、淀粉酶,、果膠酶、酯化酶等多種酶,，并能產生紅曲色素,、Monacolin類化合物、GABA,、黃酮酚,、麥角固醇等次生代謝產物，具有降膽固醇,、降血壓,、抗菌、抗氧化等生理活性,?；诩t曲霉的特點，我們在分離時先采用含有乳酸,、乙醇的培養(yǎng)基對樣進行富集培養(yǎng),，富集培養(yǎng)后再進行紅曲霉的分離。

2.1.2.5 嗜熱真菌的分離

中高溫大曲的制作大部分時間是在45℃以上的溫度下進行,，微生物多樣性分析表明中后期大曲中的真菌主要以曲霉和嗜熱真菌為主,。由于嗜熱真菌生長的最適溫度在40℃以上，實驗室常用分離真菌的溫度條件下較難生長或不生長,，不易被分離到,，白酒釀造中嗜熱真菌的分離及其功能研究較少。我們通過將分離篩選溫度提高到40度以及和增加培養(yǎng)基中氮源比例,，建立了大曲中嗜熱真菌的分離篩選模型,。

2.1.2.6 放線菌的分離

放線菌是食品釀造的重要功能微生物,，可產生淀粉酶,、蛋白酶、纖維素酶,、揮發(fā)性香味成分等，影響著食品的風味,、風格等。高通量測序分析表明大曲在后期階段放線菌尤其是高溫放線菌數量較多,，由于放線菌的生長速度相對細菌較慢，常規(guī)分離方法不易分離到放線菌,，我們采用在培養(yǎng)基中添加抗細菌抗生素和抗真菌抗生素避免細菌和真菌的干擾,，并且通過提高培養(yǎng)溫度的方法分離高溫放線菌,。

此外,，還通過培養(yǎng)基和培養(yǎng)溫度等的改變,，對大曲中的絲狀真菌進行了初步分離,。

2.1.3 釀造微生物菌株鑒定

對分離獲得的釀造微生物菌株，通過形態(tài)特征和r DNA序列分析對其進行了分類學鑒定：細菌和酵母菌采用劃線法,、絲狀真菌采用點接法培養(yǎng)后觀察菌落形態(tài),；細菌采用革蘭氏染色、真菌采用直接制片觀察顯微形態(tài),；采用CTAB法提取菌株總DNA,，細菌以27F/1492R為引物、真菌以ITS1/ITS4為引物進行PCR擴增,，擴增后的片段測序后采用NCBI的BLAST搜索程序,，將實驗中得到的序列信息與基因庫中的基因序列進行比較獲得同源性分析結果,，綜合形態(tài)特征和同源性分析結果，獲得菌株的分類學信息,。

2.1.4 菌株性能分析

基于微生物菌株的分離基質,，通過模擬大曲培養(yǎng)制條件對微生物進行培養(yǎng)，綜合多種方法對培養(yǎng)物進行分析檢測：采用生物化學方法分析培養(yǎng)物的酶活性,；采用氣相色譜（GC）,、氣相色譜-質譜聯(lián)用（GC-MS）、液相色譜（HPLC）等分析菌株培養(yǎng)物的揮發(fā)性成分和非揮發(fā)性成分,，重點分析微生物代謝產物功能性成分和風味物質特征,；借鑒現代天然產物化學研究的思路，對釀造微生物次生代謝產物進行系統(tǒng)分離和結構鑒定等,，系統(tǒng)解析微生物菌種在大曲制造過程中的作用,，目前主要研究了菌株的產酶性能和產乙醇性能。

2.1.4.1 菌株產酶性能

白酒釀造原料中存在淀粉,、蛋白質,、纖維素等大分子物質，這些物質需在淀粉酶,、糖化酶,、蛋白酶、纖維素酶等的作用下分解成還原糖,、氨基酸等小分子物質才能進而產生呈香,、呈味、呈色物質,，因而產生酶的微生物在白酒釀造中是重要的功能微生物,。將分離到的細菌接種于牛肉膏蛋白胨瓊脂斜面培養(yǎng)基、酵母菌接種于麩皮汁瓊脂斜面培養(yǎng)基,、絲狀真菌接種于PDA斜面培養(yǎng)基,，培養(yǎng)活化后細菌轉接于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基、酵母菌接種于麩皮汁液體培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)為液體種再轉接于麩皮固體培養(yǎng)基中發(fā)酵4-6 d,，絲狀真菌活化后的斜面直接轉接于麩皮固體培養(yǎng)基中發(fā)酵4 d,。固體發(fā)酵后的培養(yǎng)物加水至稀釋20倍，40℃水浴1h,，間斷攪拌,，過濾，濾液即為待測酶液,。酶活性測定分別采用下述方法：淀粉酶活性采用淀粉酶檢測試劑盒（碘-淀粉比色法，Beijing Leagene Biotechnology Co,，Ltd.）分析,；糖化酶按QBT4257-2011（釀酒大曲通用分析方法）進行,；酸性蛋白酶和中性蛋白酶按SB/T 10317-1999方法測定。

2.1.4.2 菌株產乙醇性能

將酵母菌株接種于麩皮汁瓊脂斜面培養(yǎng)基,，30℃培養(yǎng)1-2 d后轉接于含4%葡萄糖的10%豆芽汁液體培養(yǎng)基中,，30℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)1 d后再靜置培養(yǎng)3 d,，取培養(yǎng)物過濾后GC檢測乙醇,；細菌菌株接種于牛肉膏蛋白胨瓊脂斜面培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)1 d后轉接于含2%葡萄糖的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基,，30℃,、150 r/min振蕩培養(yǎng)1 d后再靜置培養(yǎng)3 d，培養(yǎng)物過濾后GC檢測乙醇,。

2.2不同微生物菌種活菌數的定量分析

針對不同微生物特有基因序列,，設計專一引物，采用qPCR技術對大曲制作關鍵時間節(jié)點的不同菌種微生物進行定量分析,，確定不同微生物菌種在大曲發(fā)酵過程中的生長,、繁殖及消亡過程，分析微生物在大曲微生態(tài)形成過程中的演替規(guī)律,，確定不同微生物菌種在大曲制作過程中的角色--功能菌（參與大曲發(fā)酵）和非功能菌（僅存在但不參與大曲發(fā)酵）,，進而確定中高溫大曲的主要功能微生物。

2.3 代表性菌種的代謝產物研究

針對大曲中的一些代表性菌種,，通過固態(tài)發(fā)酵,，有機溶劑浸提，色譜柱分離純化,，利用核磁共振,、質譜、高效液相色譜質譜聯(lián)用等現代波譜技術對菌種次級代謝產物進行結構鑒定,，研究闡明其與大曲釀造相關的生物活性,。

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研究成果

3.1 中高溫大曲微生物菌種資源庫的建立

3.1.1 微生物多樣性分析

3.1.1.1 細菌

A. 企業(yè)1

入房曲中細菌相對豐度最高的是泛菌屬的成團泛生菌（Pantoea agglomerans），相對豐度為40.8%,，其次是屬于乳酸菌類的融合魏斯氏菌（Weissella confusa）,，相對豐度為32.7%。

發(fā)酵初期相對豐度最高的是融合魏斯氏菌（Weissella_confusa）,，相對豐度為38.8%,，其次為乳酸菌類的食品乳桿菌（Companilactobacillus paralimentarius），相對豐度為27.8%,。

發(fā)酵中前期相對豐度最高的成團泛生菌（Pantoea agglomerans）,，相對豐度為29.4%，其次為腐生葡萄球菌（Staphylococcus saprophyticus）和陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae）,，相對豐度分別為14%和13.2%,。

發(fā)酵中后期相對豐度最高的是克羅彭斯特菌屬的Kroppenstedtia eburnea,，相對豐度為53.7%，其次是腐生葡萄球菌（Staphylococcus saprophyticus）,，相對豐度為10.9%,。

貯存1個月大曲中相對豐度最高的是乳酸菌類的檸檬明串珠菌（Leuconostoc citreum），相對豐度為40.9%,，其次為克羅彭斯特菌屬的血液克羅彭斯特菌（Kroppenstedtia sanguinis）,，相對豐度為39.9%。

曲粉中相對豐度最高的是血液克羅彭斯特菌（Kroppenstedtia sanguinis）,，相對豐度為54.1%,，其次是高溫放線菌屬的普通嗜熱放線菌（Thermoactinomyces vulgaris），相對豐度為11.4%,。

B. 企業(yè)2

入房曲中相對豐度最高的乳酸菌為的乳明串珠菌（Leuconostoc lactis）,，相對豐度為46.0%；其次是成團泛生菌（Pantoea agglomerans）,，其相對豐度為28.2%,；第三是葡糖桿菌屬的日本葡糖桿菌（Gluconobacter japonicus），相對豐度為8.6%,。

發(fā)酵1天的曲中相對豐度最高的是葡萄球菌屬的雞葡萄球菌（Staphylococcus gallinarum）,，相對豐度為57.5%。其次是乳酸菌類的發(fā)酵乳酸桿菌（Limosilactobacillus fermentum）和植物乳植桿菌（Lactiplantibacillus plantarum）,，相對豐度分別為22.6%和7.8%,。

發(fā)酵3天的曲中相對豐度最高的是發(fā)酵乳酸桿菌（Limosilactobacillus fermentum），相對豐度為47.3%,；其次是雞葡萄球菌（Staphylococcus gallinarum）和乳酸菌類的戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）,，其相對豐度分別為28.1%和13.6%。

發(fā)酵5天的曲中相對豐度最高的是乳酸菌類的發(fā)酵乳酸桿菌（Limosilactobacillus fermentum）,，相對豐度為56.8%,；其次是雞葡萄球菌（Staphylococcus gallinarum）和戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus），相對豐度分別為26.6%和8.2%,。

發(fā)酵8天的曲中相對豐度最高的是雞葡萄球菌（Staphylococcus gallinarum）,，相對豐度為48.6%；其次是發(fā)酵乳酸桿菌（Limosilactobacillus fermentum）和霍氏糖多孢菌（Saccharopolyspora hordei）,，相對豐度分別為14.3%和8.5%,。

發(fā)酵11天中相對豐度最高的是大曲高溫放線菌（Thermoactinomyces daqus），相對豐度為50.4%,；其次是雞葡萄球菌（Staphylococcus gallinarum）和發(fā)酵乳酸桿菌（Limosilactobacillus fermentum）,，相對豐度分別為17.7%和12.5%。

發(fā)酵15天曲中相對豐度最高的是直桿糖多孢菌（Saccharopolyspora rectivirgula），相對豐度為39.2%,；其次是普通高溫放線菌（Thermoactinomyces vulgaris）和雞葡萄球菌（Staphylococcus gallinarum）,，相對豐度分別為10.0%和 9.2%。

發(fā)酵20天曲中相對豐度最高的血液克羅彭斯特菌屬（Thermoactinomyces sanguinis）,，相對豐度為56.6%；其次是直桿糖多孢菌（Saccharopolyspora rectivirgula）,，相對豐度為32.7%,。

發(fā)酵25天曲中相對豐度最高的是直桿糖多孢菌（Saccharopolyspora rectivirgula），相對豐度為28.1%,；其次是發(fā)酵乳酸桿菌（Limosilactobacillus fermentum）和普通高溫放線菌（Thermoactinomyces vulgaris）和,，相對豐度分別為16.9%和10.0%。

發(fā)酵30天的曲中相對豐度最高的是直桿糖多孢菌（Saccharopolyspora rectivirgula）,，相對豐度為44.2%,；其次是雞葡萄球菌（Staphylococcus gallinarum），其相對豐度為19.3%,。

兩家企業(yè)的大曲發(fā)酵前期均以乳酸菌為主,，發(fā)酵過程中葡萄球菌數量較多，后期以耐高溫的高溫放線菌為主,。芽孢桿菌的數量較少,，相對豐度均在5%以下。

3.1.1.2 真菌

A.企業(yè)1

入房曲中相對豐度最高的是損毀鏈格孢（Alternaria destruens）,，相對豐度為71.9%,。

發(fā)酵初期相對豐度最高的是節(jié)孢酵母屬的Blastobotrys raffinosifermentans，相對豐度為34.8%,，其次是庫德里阿茲氏畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）,，相對豐度為19.8%。

發(fā)酵中前期相對豐度最高的是嗜熱子囊菌（Thermoascus aurantiacus）,，相對豐度為43.8%，其次是庫德里阿茲氏畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）,，相對豐度為22.1%,。

發(fā)酵中后期相對豐度最高的是嗜熱子囊菌（Thermoascus aurantiacus），相對豐度為83.0%,，其次是疏棉狀嗜熱絲孢菌（Thermomyces lanuginosus）,，相對豐度為8.3%。

貯存1個月曲中相對豐度最高的嗜熱子囊菌（Thermoascus aurantiacus）,，相對豐度為55.2%,，其次是米曲霉（Aspergillus oryzae），相對豐度為21.5%。

曲粉中相對豐度最高的是嗜熱子囊菌（Thermoascus aurantiacus）,，相對豐度為51.7%,，其次是疏棉狀嗜熱絲孢菌（Thermomyces lanuginosus），相對豐度為17.6%,。

企業(yè)2的真菌結果還在檢測中。

發(fā)酵前期真菌以酵母為主,，中后期以耐熱的嗜熱真菌為主,，貯存后曲霉數量增加。

3.1.2 釀造微生物菌株分離,、鑒定及性能分析

白酒釀造研究中,，微生物純菌種的獲得非常重要。雖然分子生物學技術可發(fā)現微生物物種,、遺傳,、代謝等方面豐富的多樣性， 但是單純運用分子生物學技術對復雜體系中特異微生物群體進行生理學和代謝分析還存在很大的難度,。尤其是研究微生物功能,、微生物互作關系、發(fā)酵機理等更需在純菌種基礎上進行,。我們以高通量測序獲得的群落結構為基礎,，以生物酶、風味成分,、生理活性成分及特定菌株為篩選目標,，設計培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，分離收集大曲微生物,，共獲得100個種的微生物菌種,。以下示例部分菌株的分離結果。

（1）芽孢桿菌

芽孢桿菌是大曲中的主要微生物,，尤其是大曲制作后期,，隨著溫度的升高，其它不耐熱的細菌逐漸衰亡,，芽孢桿菌成為優(yōu)勢微生物,。目前我們從兩個企業(yè)的中高溫大曲中共分離到9種芽孢桿菌（表-1），除特基拉芽孢桿菌和阿耶波多芽孢桿菌外,，其它菌種在兩種大曲中均分離到,，定性分析表明這些芽孢桿菌均能產生蛋白酶和淀粉酶。

（2）乳酸菌

微生物群落結構分析的結果表明乳酸菌是大曲制作起始階段的主要類群,，因為怕乳酸乙酯過高,，乳酸菌在白酒釀造中通常被認為是有害菌,，需要抑制其生長。而乳酸菌在其它的發(fā)酵食品如酸奶,、奶酪,、泡菜、豆瓣等及人體益生菌中均是主要的功能菌,，乳酸菌代謝的乳酸是發(fā)酵食品中的重要風味成分,，白酒中的適量的乳酸對白酒的風味也有積極的貢獻，能夠掩蓋酒精的味道,，從而降低白酒的刺激感,，增加酒體的綿柔度，并且能有效地緩解酒中的酯類水解,，促進酒體的穩(wěn)定。乳酸與發(fā)酵環(huán)境中其它物質反應生成的乳酸乙酯香味弱,，味微甜,，可增加酒體的醇甜感和醇厚度，延長酒體的后味,，較高含量的乳酸乙酯是中國白酒區(qū)別于國外蒸餾酒的顯著特征,。乳酸菌產生的乳酸還可維持酸性的釀造環(huán)境，有效地抑制部分雜菌的代謝活動,，改善釀造生產的微生態(tài)環(huán)境,。

無論是抑制或是利用，純菌種的獲得都是必要的,，通過設計培養(yǎng)基組分,、改變培養(yǎng)條件等方法，目前從兩個大曲樣品中分離到7種乳酸菌（表-2）,，除了產乳酸外,，這些菌株其它的作用還有待深入研究。

（3）放線菌

放線菌是食品釀造的重要功能微生物,，可產生淀粉酶,、蛋白酶、纖維素酶,、揮發(fā)性香味成分等,，影響著食品的風味、風格等,。放線菌在大曲制作階段普遍存在,，尤其中后期，由于溫度的升高,，一些耐熱的放線菌大量繁殖,。常規(guī)分離大曲微生物時，由于其它細菌的迅速生長，抑制了放線菌的繁殖,，我們通過培養(yǎng)基成份的調整及應用不同培養(yǎng)溫度,，在大曲制作的不同階段均分離到了放線菌，目前共分離到5個種（表-3）,，其中3種均屬于高溫放線菌,，最適生長溫度45℃，能在50℃生長,。

（4）酵母菌

酵母菌是白酒自然發(fā)酵中的重要微生物,，其代謝產物是呈味和呈香物質的主要組分。酵母菌可代謝乙醇,、乙酸,、乙酸乙酯等，乙酸乙酯及乙醇參與形成的乳酸乙酯,、己酸乙酯等是白酒的骨架風味成分,。高通量測序的結果表明酵母菌是大曲發(fā)酵初始階段的主要菌群，酵母菌的繁殖可形成低氧,、微酸環(huán)境,，加上乙醇的作用，可抑制雜菌,，從而凈化釀造的微生態(tài)環(huán)境,。通過對不同發(fā)酵階段大曲的分離篩選，目前共獲得12種酵母菌（表-4,，圖-4）,。

（5）紅曲霉

紅曲霉的發(fā)酵產物紅曲是食療兩用的傳統(tǒng)中藥材，在食品及中藥上的應用已逾千年,。最早被用于釀造黃酒,，后來在制造腐乳、食醋,、食用色素及中藥上均有廣泛應用,。紅曲霉嗜酸，特別喜乳酸,，耐高溫,，耐乙醇，耐缺氧,，能產生蛋白酶,、淀粉酶、果膠酶,、酯化酶等多種酶,，并能產生紅曲色素,、Monacolin類化合物、GABA,、黃酮酚,、麥角固醇等次生代謝產物，具有降膽固醇,、降血壓,、抗菌、抗氧化等生理活性,。

大曲起始階段乳酸菌和酵母菌的生長提供了乳酸,、乙醇，為紅曲霉提供了適宜的生長條件,，大曲中紅曲霉產生的各種酶系可將大分子物質酶解，為白酒香味物質的產生提供前體物質,，次生代謝產物還可增加白酒中具生理活性的微量成分,。我們從兩種大曲中分離到4種紅曲霉（表-5），均能在2%乳酸或10%乙醇中生長,，能產生酯化酶、淀粉酶,、蛋白酶,。

表-5 大曲中分離到的紅曲霉

（6）其他絲狀真菌

米曲霉、黑曲霉,、根霉,、毛霉等絲狀真菌可產生蛋白酶、淀粉酶等生物酶,，可將糧谷原料中的蛋白質,、淀粉等酶解成小分子物質，可為產酒,、產香提供前體物質,。通過培養(yǎng)基和培養(yǎng)溫度等的改變，對大曲中的絲狀真菌進行了初步分離,，除分離到上述常見絲狀真菌外,，還分離到多種目前研究較少的絲狀真菌，示例如下表,。

表-6 大曲中分離到的絲狀真菌?

除上述示例的53種菌種外,，在大曲中分離到的其它47種菌種名稱如表-7

表- 7 大曲中的其它微生物菌種

3.3 典型菌株代謝產物分析

3.3.1大曲中的謝瓦散囊菌研究

（1）散囊菌次級代謝產物分離純化和結構鑒定

散囊菌是一類嗜高滲透壓的微生物，孢子中度耐熱,，能適應高糖,、高鹽等形成的高滲環(huán)境,，茯磚茶中“金花”的優(yōu)勢微生物是冠突散囊菌，冠突散囊菌是茯磚茶中香味的主要來源,，氣相色譜分析表明茯磚茶內的醛酮類化合物和吡嗪類雜環(huán)化合物的含量都隨茯磚茶中散囊菌的變化而變化,，說明散囊菌具有一定的生香或促進產香的功能。

大曲中散囊菌廣泛存在,，尤其大曲制作中后期,，大曲斷面呈現的黃色點狀區(qū)中散囊菌數量較多。因此,，我們利用微生物分離純化技術獲得了大曲中的散囊菌,，并通過宏觀微觀形態(tài)觀察與ITS分子測序技術將其鑒定為謝瓦散囊菌（Eurotium Chevalieri YT411）（圖-15）。

圖-15 ?謝瓦散囊菌菌絲體及形態(tài)特征（Eurotium Chevalieri YT411）

為闡明釀酒大曲中散囊菌的次級代謝產物,，我們采用規(guī)?；囵B(yǎng)方式對該菌固態(tài)發(fā)酵，進一步采用有機溶劑浸提,、色譜層析分離和核磁共振（NMR）,、質譜（MS）等波譜手段對散囊菌的次級代謝產物進行了深入研究，發(fā)現謝瓦散囊菌YT411能夠產生多種類型的活性次級代謝產物,，包括2-hydroxydiplopterol（1）,、大黃素（2）、大黃素甲醚（3）,、大黃酸（4）,、11,14-dihydroxylneoechinulin E（5）、,、neoechinulin E（6）,、neoechinulin A（7）、echinulin（8）,、eurocristatine（9）和cristatumin E（10）,、hexylitaconic acid（11）和kojic acid（12）（圖-16）。

圖-16 散囊菌次級代謝產物

（2）謝瓦散囊菌代謝產物的化學生態(tài)學研究

微生物次級代謝產物是微生物之間相互作用的橋梁,，產生具有抗菌活性的小分子次級代謝產物是微生物生存和競爭的重要方式,。因此，我們對謝瓦散囊菌中分離得到的次級代謝產物進行了抗菌活性的研究,。研究結果表明,，謝瓦散囊菌產生的大黃素（2）、大黃素甲醚（3）和大黃酸（4）在100μg/mL的濃度下能夠顯著抑制金黃色葡萄球菌（S. aureus）和糞腸球菌（E. faecalis）的生長,。生物膜是微生物群落附著在基質或表面并被自身合成的胞外基質包裹形成的復合物,。細菌生物膜為細菌提供保護層，阻止抗生素進入,，使細菌表現出抗抗生素能力,。因此,，進一步測試了謝瓦散囊菌次級代謝產物抑制細菌生物膜形成的活性，結果顯示大黃素（2）,、大黃素甲醚（3）和大黃酸（4）均能抑制金黃色葡萄球菌生物膜的形成,。而二酮哌嗪類化合物化合物neoechinulin A（7）、echinulin（8）和eurocristatine（9）能夠抑制大腸桿菌生物膜的形成,。

同時,，我們發(fā)現化合物11,14-dihydroxylneoechinulin E屬于鐵離子載體分子，其具有十分強的鐵離子結合能力,，能從鐵離子濃度極低的環(huán)境下收集鐵離子,，將其轉運到菌體內，為散囊菌的生長提供必須的鐵元素,。同時,，其它的二酮哌嗪類分子也是鐵載體分子的前體物質。因此散囊菌中高含量的二酮哌嗪類次級代謝產物在其生存,、繁殖和競爭中發(fā)揮重要作用,。

（3）大曲中謝瓦散囊菌代謝產物分析

建立謝瓦散囊菌特征次級代謝產物的指紋譜圖，對研究散囊菌在大曲中的演替規(guī)律及機制具有重要意義,。因此,，我們摸索建立了謝瓦散囊菌次級代謝產物的高效液相指紋譜圖，并利用高效液相色譜和高分辨質譜聯(lián)用技術（HPLC-MS）對散囊菌固態(tài)發(fā)酵物中特征次級代謝產物進行了分析,，通過紫外特征譜圖和準確分子式確定了謝瓦散囊菌特有二酮哌嗪類次級代謝產物主要包括：Neoechinulin E（6）,、neoechinulin A（7）、echinulin（8）,、eurocristatine（9）和cristatumin E（10）（圖-17）。其中新海膽靈A（Neoechinulin A,，tR=1.41）和海膽靈（Echinulin,，tR=8.36）在散囊菌次級代謝產物中含量較高，適合作為大曲中謝瓦散囊菌定性分析的特征指紋分子,。

圖-17散囊菌次級代謝產物UPLC指紋圖譜

圖-18 散囊菌次級代謝產物離子流圖

表-8 謝瓦散囊菌特有的二酮哌嗪次級代謝產物

取不同發(fā)酵培養(yǎng)時間的大曲,，以乙酸乙酯對大曲中散囊菌特征代謝產物，進行了提取,，進一步通過HPLC-HRESIMS技術對大曲提取物中散囊菌特征代謝產物Neoechinulin A（tR = 1.41）和Echinulin（tR = 8.36）進行了定性分析,，結果表明培養(yǎng)20天的大曲中可以明顯檢測到散囊菌特征代謝產物（圖-19,20）。

圖-19大曲中Neoechinulin A的離子流及分子量

圖-20 大曲中Echinulin A的離子流及分子量

通過對分離得到的次級代謝產物的結構特點和活性分析,，首次發(fā)現大曲中的散囊菌能夠代謝產生一種具有廣泛抗菌活性的蒽醌類小分子化合物大黃酸,，其在大曲中散囊菌的生在繁殖競爭中扮演了十分重要的作用。同時,，我們首次分析發(fā)現,，該散囊菌還代謝產生了結構類型豐富的二酮哌嗪類化合物,，該類化合物為鐵載體小分子化合物，其具有十分強的鐵離子絡合能力,，可以幫助散囊菌在大曲中獲得微生物生長必須的鐵離子,，通過競爭，可以剝奪其它微生物生長必須的鐵離子,，進而獲得生長繁殖的競爭優(yōu)勢,。該研究為大曲中功能微生物之間的化學生態(tài)學相互作用研究提供了新的思路。

（4）散囊菌與大曲中代表性微生物相互作用研究

在大曲發(fā)酵后期,，散囊菌逐漸發(fā)展演替成為了優(yōu)勢菌群,，研究散囊菌與其它菌的相互作用可一定程度揭示其演替機制。因此,，我們將散囊菌與大曲中代表性菌株放線菌,、地衣芽孢桿菌桿菌分別進行了共培養(yǎng)實驗。實驗結果表明,，在放線菌和散囊菌共培養(yǎng)中,，散囊菌生長菌絲體顯著增加，散囊菌能夠產生更多的色素代謝產物,。對共培養(yǎng)中散囊菌特有次級代謝產物的含量分析表明,，與放線菌共培養(yǎng)促進了散囊菌中代謝產物Neoechinulin A（tR=6.36）和Echinulin（tR=24.02）合成，其產量分別提高了11.7%和9.7%（圖-21）,。當散囊菌與地衣芽孢桿菌共培養(yǎng)時,，散囊菌菌絲體顯著減少，地衣芽孢桿菌抑制散囊菌的生長,，同時散囊菌的特有代謝產物Neoechinulin A降低了70.6%,、Echinulin降低了51.2%

圖-21 ?散囊菌、放線菌和地衣芽孢桿菌共培養(yǎng)指紋圖譜

3.3.2 大曲中菌核青霉代謝產物研究

前期在對大曲中微生物的分離中得到了一株菌核青霉,，通過色譜分離和波譜鑒定對該菌固態(tài)發(fā)酵物中的次級代謝產物進行了研究,，在該菌中鑒定了一系列azaphilone類真菌色素和一些酚酸類化合物（圖-22）?？咕钚员砻鱝zaphilone類真菌色素和酚酸類化合物2,4-dihydroxy-6-((3E,5E)-nona-3,5-dien-1-yl)-benzoic acid (4), carnemycin B (5), stromecycin (6)對革蘭氏陽性菌枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌具有一定的生長抑制活性,。

圖-22 菌核青霉的次級代謝產物

3.3.3 根霉次級代謝產物研究

根霉是大曲發(fā)酵中常見的功能微生物，研究根霉的次級代謝產物,，分析其結構與功能將有助于了解根霉在大曲演替機理,。因此，我們對根霉進行了固態(tài)培養(yǎng),，并利用色譜和波譜技術對根霉的次級代謝產物進行了研究,，從根霉發(fā)酵物中分離鑒定了8個主要成分，主要包括麥角甾醇（1）,、過氧麥角甾醇（2）,、3,5,6-三羥基麥角甾醇（3）,、對羥基苯甲酸（4）、對羥基苯甲酸甲酯（5）,、對羥基苯乙酸（6）,、對羥基苯乙酸甲酯（7）、3-(4-羥基苯基)乳酸（8）和L-苯基乳酸（9）,，其結構如圖所示,。

圖-23 根霉次級代謝產物

3.3.4大曲來源的根毛霉、黑曲霉,、米曲霉,、圓弧青霉、熱子囊菌真菌次級代謝產物研究

以麩皮為培養(yǎng)基,，對大曲來源的根毛霉,、黑曲霉、米曲霉,、圓弧青霉和熱子囊菌進行了固態(tài)發(fā)酵,，發(fā)酵時間為15天。發(fā)酵完成后,，采用薄層層析色譜技術（thin layer chromatography）對其固態(tài)發(fā)酵物中的次級代謝產物分析了,，分析結果表明這幾種真菌的次級代謝產物種類較單一，特征成分基本一致,，主成分包括麥角甾醇,、過氧麥角甾醇和一些有機酸類分子。

3.4 大曲中代表性微生物之間互作研究

以麩皮為原料,，將大曲來源的代表性微生物地衣芽孢桿菌,、白色鏈霉菌、散囊菌,、根毛霉,、黑曲霉、米曲霉和熱子囊菌進行組合共培養(yǎng)實驗,，通過薄層層析色譜技術分析共培養(yǎng)菌株的生長情況，結果表明白色鏈霉菌與米曲霉,、散囊菌,、黑曲霉、熱子囊菌具有互生關系,，其對米曲霉和散囊菌的促生長效果尤為顯著,，但地衣芽孢桿菌對米曲霉、根霉,、熱子囊菌,、根毛霉和黑曲霉的生長菌表現出抑制作用,。

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成果表達

1、菌株實物100種,；

2,、申報專利三項，其中授權專利1項

（1）楊濤,李國友,陳曉珍,姚燦,，一種產液化型淀粉酶的根毛霉菌及應用,，授權(ZL201910726904.5)。

（2）李國友,，張國林,，楊濤，錢雪情,，劉玲艷,，秦張一，一種毛殼菌菌株及其發(fā)酵生產的具有神經保護活性的化合物,，申請?zhí)枺篊N2022102144238,。

（3）李國友，楊濤,，張霞,，張國林，一種具有抗炎活性的水溶性紅色食用真菌色素及其制備方法和用途, 申請?zhí)枺篊N202110432757,。

3,、論文發(fā)表情況；

（1）Xia Zhang, Yeye Hu, Tao Yang, Xueqing Qian, Weicheng Hu, Guoyou Li. Penazaphilones J–L, Three new hydrophilic azaphilone pigments from Penicillium sclerotiorum cib-411 and their anti-inflammatory activity. Molecules, 2023, 28, 3146.

（2）Lingyan Liu, Xueqing Qian, Tao Yang, Dongmei Fang, Zhangyi Qin, Bo Ren, and Guoyou Li*, Cyclopiazonic Acid and Okaramine Analogues, Including Chlorinated Compounds, from Chrysosporium undulatum YT-1, Journal of Natural Products, 2022, 85(11): 2547-2556.

（3）張春英,，秦張一,，錢雪情，楊濤,，李國友. 一株釀酒大曲菌散囊菌次級代謝產物及生物活性研究（待發(fā)表）,。

（4）張春英，楊濤,，李國友. 釀酒大曲中幾種優(yōu)勢微生物演替規(guī)律研究（待發(fā)表）,。

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行業(yè)效益與人才培養(yǎng)

為企業(yè)技術人員進行了大曲功能微生物分離鑒定相關培訓，共3人,。

為行業(yè)培養(yǎng)從事釀酒微生物活性物質研究的研究生2人,。

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下一步研究計劃

1、系統(tǒng)考察大曲中微生物的生長變化規(guī)律,，確定大曲釀造的功能微生物菌種,。

2、比較不同大曲中優(yōu)勢功能菌株的差異和演替規(guī)律。