中國白酒技術(shù)創(chuàng)新戰(zhàn)略發(fā)展委員會(huì)第四期科研項(xiàng)目匯報(bào)（2023年）

課題名稱：小麥源微生物在高溫大曲制曲過程中的遷移規(guī)律和作用機(jī)制

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立項(xiàng)背景

“曲為酒之骨”,，大曲作為白酒糖化發(fā)酵劑歷史悠久,，至今仍具有無法替代的作用。其制作過程通常采用開放式的自然接種形式,，原料和環(huán)境微生物的參與形成了復(fù)雜獨(dú)特的微生物群落,，對(duì)于白酒獨(dú)特風(fēng)味和品質(zhì)的形成具有重要意義。通過網(wǎng)羅原料和環(huán)境微生物的多菌種混合發(fā)酵是高溫大曲制作過程的典型特征,，以小麥為原料的固態(tài)基質(zhì)既是微生物的營(yíng)養(yǎng)源也是重要的生長(zhǎng)微環(huán)境,。目前，主要依靠經(jīng)驗(yàn)控制的制曲工藝是制約大曲品質(zhì)穩(wěn)定性和生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)化的主要問題,。

原料是保證大曲微生物組形成和質(zhì)量穩(wěn)定性的關(guān)鍵因素,。原料源微生物菌群在制曲過程中微生物組的組裝和風(fēng)味物質(zhì)的形成至關(guān)重要。葡萄球菌是重要的芳香化合物生產(chǎn)者,，乳酸菌產(chǎn)生的乳酸是乳酸乙酯形成的前體物質(zhì),，芽孢桿菌是大曲中淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶的重要貢獻(xiàn)者,。原料中的功能微生物能夠驅(qū)動(dòng)制曲過程中微生物群落的演替,。通過構(gòu)建關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)觀測(cè)優(yōu)勢(shì)小麥源微生物在大曲菌群中的生態(tài)位作用有利于制曲過程中功能微生物的篩選。制曲過程涉及到微生物富集,、初級(jí)和次級(jí)代謝,，富集的微生物進(jìn)一步相互作用，形成平衡穩(wěn)定的混合菌群,，經(jīng)過一系列復(fù)雜的演替過程,，最終在白酒釀造過程中發(fā)揮作用。

近年來,，研究人員采用多種方法,，如利用傳統(tǒng)培養(yǎng)法對(duì)可培養(yǎng)微生物進(jìn)行分離純化，利用分子生物學(xué)方法對(duì)不可培養(yǎng)微生物進(jìn)行鑒定等對(duì)不同類型大曲的微生物多樣性進(jìn)行研究，得到了一些大曲微生物多樣性以及微生物群落結(jié)構(gòu)演替規(guī)律的結(jié)論,。但原料源功能微生物在制曲過程中的遷移演變規(guī)律及其對(duì)大曲功能及品質(zhì)特征的影響尚不清楚,。基于此,，本項(xiàng)目擬采用高通量測(cè)序技術(shù)和傳統(tǒng)培養(yǎng)法追蹤高溫大曲制曲過程中微生物群落演替并挖掘發(fā)酵過程中的原料源功能微生物,，進(jìn)一步借助宏代謝組學(xué)技術(shù)分析制曲過程中的特征風(fēng)味物質(zhì)和非揮發(fā)性代謝物的變化，闡明原料源功能微生物在制曲過程中的遷移規(guī)律及其對(duì)大曲風(fēng)味代謝功能的調(diào)控作用,，基于菌系,、物系和酶系多層面揭示原料源功能微生物在強(qiáng)化大曲中的應(yīng)用潛力，為建立原料選用標(biāo)準(zhǔn)和提高大曲品質(zhì)奠定理論基礎(chǔ),，也為實(shí)現(xiàn)傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵工業(yè)化和標(biāo)準(zhǔn)化提供技術(shù)支持,。

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主要研究?jī)?nèi)容

2.1 制曲過程中微生物群落組成分析

采集小麥和制曲過程中不同階段的大曲樣本，并對(duì)其微生物進(jìn)行傳統(tǒng)培養(yǎng)法和高通量測(cè)序結(jié)合分析,。通過擴(kuò)增子測(cè)序技術(shù)測(cè)定原料和大曲菌群結(jié)構(gòu),，并進(jìn)行對(duì)比和溯源分析，綜合分析制曲過程中菌群和代謝功能的動(dòng)態(tài)變化,，明確制曲過程中微生物遷移規(guī)律,。

2.2 制曲過程中的風(fēng)味物質(zhì)和代謝物變化分析

制曲過程中的大曲樣本同時(shí)進(jìn)行風(fēng)味物質(zhì)和非揮發(fā)性代謝物的分析，結(jié)合微生物分析結(jié)果進(jìn)行關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)分析,，挖掘重要微生物的代謝特征,，表征微生物與風(fēng)味物質(zhì)之間的關(guān)系，討論微生物在制曲過程中的代謝功能,，從更客觀的角度闡明小麥源微生物對(duì)大曲菌群和風(fēng)味物質(zhì)的貢獻(xiàn),。

2.3 小麥源功能微生物的篩選及其在強(qiáng)化大曲中的作用

結(jié)合已有對(duì)高溫大曲中純培養(yǎng)小麥源微生物功能的研究結(jié)果以及群落的結(jié)構(gòu)分析結(jié)果，尋找對(duì)高溫大曲群落貢獻(xiàn)較大的微生物,。測(cè)定菌株環(huán)境耐受性和產(chǎn)酶活性，篩選得到小麥源功能微生物,。通過模擬大曲固態(tài)發(fā)酵體系,，探索外源添加小麥源功能微生物對(duì)大曲微生物群落組成、代謝物譜和釀酒功能特性的影響,，進(jìn)而闡明小麥源微生物對(duì)于高溫大曲的重要意義,。

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研究結(jié)果

3.1 小麥和大曲中的可培養(yǎng)微生物計(jì)數(shù)

采集制曲原料小麥和制曲培菌第0、4,、7,、12、15,、27,、40天的過程曲樣品進(jìn)行可培養(yǎng)微生物計(jì)數(shù)，結(jié)果如圖1-1所示。小麥攜帶著一定數(shù)量的細(xì)菌和真菌,，參與到大曲微生物群落的初始組裝,，之后可培養(yǎng)微生物的數(shù)量呈現(xiàn)一定的波動(dòng)變化，需氧菌落總數(shù),、耐熱菌數(shù),、乳酸菌和真菌的數(shù)量均在培菌前4天有明顯的上升趨勢(shì)并在第4天達(dá)到峰值。剛?cè)雮}時(shí)曲塊核心溫度上升緩慢,，濕度大,，適宜微生物的生長(zhǎng)，此階段以培養(yǎng)霉菌和富集酶系為主,。培菌第7天,，進(jìn)行第一次人工翻曲以調(diào)節(jié)不同位置曲塊的溫度和濕度相對(duì)均勻，此時(shí)可培養(yǎng)微生物數(shù)量有明顯的下降趨勢(shì),，之后溫度又逐漸攀升,，有利于耐熱菌尤其是芽孢桿菌的生長(zhǎng)繁殖，而霉菌的生長(zhǎng)此后逐漸受到抑制,，乳酸菌的耐熱性也較差因此數(shù)量也有所減少,。第40天培菌結(jié)束時(shí)，需氧菌落總數(shù),、耐熱菌數(shù),、乳酸菌和真菌數(shù)量分別達(dá)到了7.56、6.62,、4.50和4.60 log CFU/g,。

圖1-1 小麥和大曲中可培養(yǎng)微生物數(shù)量

注：Wheat，小麥樣品,；Mix_n,，培菌第n天的大曲樣品；Total aerobic bacteria,，需氧菌落總數(shù),；Thermotolerant bacteria，耐熱菌數(shù),；Lactic bacteria,，乳酸菌，F(xiàn)ungi 真菌,。不同字母標(biāo)注代表具有顯著性差異(Duncan檢驗(yàn),，P < 0.05)

3.2 小麥和大曲微生物群落結(jié)構(gòu)分析

在分析不同樣品微生物多樣性差異的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對(duì)小麥和大曲微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行探討,。首先通過Krona物種組成圖將不同分類學(xué)水平小麥源細(xì)菌的組成進(jìn)行可視化展示,，如圖2-1 (a)所示,。小麥中細(xì)菌門水平以變形菌門（Proteobacteria）和厚壁菌門（Firmicutes）為主，總占比超過80%,，其中厚壁菌門主要以葡萄球菌屬（Staphylococcus）為主,。變形菌門中主要是泛菌屬（Pantoea），假單胞菌屬（Pseudomonas）,，博克氏菌屬（Burkholderia）和馬賽菌屬（Massilia）,。PacBio SMRT測(cè)序提高了微生物種水平的鑒定能力，在小麥中檢出了相對(duì)豐度分別為15.00%的唐菖蒲伯克霍爾德菌（Burkholderia gladioli）,，9.65%的金色馬賽菌（Massilia aurea）和5.09%的松鼠葡萄球菌（Staphylococcus sciuri）,。唐菖蒲伯克霍爾德菌是一種植物病原菌，常常導(dǎo)致谷類等腐爛,，目前關(guān)于其在大曲中的發(fā)酵特性還未明確,，啟示我們要密切關(guān)注一些植物病原菌，對(duì)原料質(zhì)量嚴(yán)格把控,，預(yù)防由植物病原菌引起的大曲品質(zhì)下降,。

小麥微生物的真菌結(jié)構(gòu)如圖2-1 (b)所示，子囊菌門（Ascomycota）豐度為64.34%,，其次為擔(dān)子菌門（Basidiomycota）(3.64%),。在屬水平，鏈格孢屬（Alternaria）和球腔菌屬（Mycosphaerella）是豐度最優(yōu)勢(shì)的菌屬,，分別占比41.55%和17.12%,，進(jìn)一步種水平的鑒定結(jié)果表明鏈格孢屬幾乎全為Alternaria eichhorniae，而球腔菌屬則均檢出為Mycosphaerella tassiana,。擔(dān)子菌門中的真菌幾乎全部為擲孢酵母屬（Sporobolomyces）屬的Sporobolomyces roseus,。

圖2-1 通過Krona可視化小麥源微生物群落結(jié)構(gòu)

進(jìn)一步，圖2-2展示了更為詳細(xì)的不同分類學(xué)水平細(xì)菌和真菌的組成情況,。就細(xì)菌而言,，厚壁菌門在整個(gè)培菌過程中均為豐度最優(yōu)勢(shì)的微生物，在培菌第4天時(shí)相對(duì)豐度達(dá)到最高,，超過90%,，隨后呈波動(dòng)下降趨勢(shì)且豐度始終高于50%。變形菌門同樣存在于培菌始末,，相對(duì)豐度受溫度影響較明顯，波動(dòng)較為劇烈,。以上二者在小麥源細(xì)菌中總占比超過80%,，說明小麥源細(xì)菌和培菌過程大曲的細(xì)菌輪廓具有一定相似性。在屬水平,，小麥源細(xì)菌和培菌初期大曲細(xì)菌組成較為相似,，但與中后期過程曲菌群差異較大，尤其體現(xiàn)在高溫放線菌屬（Thermoactinomyces）和芽孢菌屬（Bacillus）。對(duì)于真菌,，小麥和大曲豐度最高的皆為子囊菌門（Ascomycota）,，子囊菌門在高溫大曲培菌過程中優(yōu)勢(shì)明顯，從第7天開始相對(duì)豐度保持在90%以上,。在屬水平,，小麥為大曲發(fā)酵提供了豐富的鏈格孢屬和一定豐度的曲霉菌屬（Aspergillus），從培菌中期開始嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）占據(jù)豐度優(yōu)勢(shì)并持續(xù)到培菌結(jié)束,。

圖2-2 小麥和大曲樣品中不同分類學(xué)水平微生物的相對(duì)豐度(結(jié)果以組內(nèi)均值展示)

注：柱狀圖展示了門水平細(xì)菌(a)和真菌(b)群落組成,；Circos圖展示了屬水平細(xì)菌(c)和真菌(d)組成；氣泡圖展示了種水平細(xì)菌(e)和真菌(f)組成,。

3.3 標(biāo)志微生物的挖掘和微生物功能預(yù)測(cè)

使用ASV豐度表制作的韋恩圖,，展示了不同組間共有和特有的ASV個(gè)數(shù)如圖3-1所示，無論是細(xì)菌還是真菌,，都不存在所有樣品共ASV,，這說明培菌過程中菌群發(fā)生了劇烈的演替，小麥和培菌初始階段大曲樣品中的特有真菌ASV數(shù)目遠(yuǎn)多于中后期大曲樣品,。

圖3-1 小麥和大曲中細(xì)菌(a)和真菌(b)韋恩圖

在韋恩圖的基礎(chǔ)上,，LEfSe分析直接對(duì)所有分類水平同時(shí)進(jìn)行差異分析，強(qiáng)調(diào)尋找培菌過程中不同分組之間穩(wěn)健的差異物種,，即標(biāo)志物種(biomarker),，且篩選在不同子分組中表現(xiàn)一致的差異微生物類群。這部分研究的目的更傾向于探尋培菌過程中的菌群演替規(guī)律和不同階段的菌群特征,，因此區(qū)別于上述韋恩圖展示的結(jié)果,。LEfSe分析所展示的物種分類學(xué)分枝圖和LDA柱狀圖剔除了小麥樣本，將研究對(duì)象集中于培菌過程的大曲,。如圖3-2所示,，LEfSe分析結(jié)果包括兩部分，分別為物種分類學(xué)分枝圖,，用以展示在各組樣品中標(biāo)志物種的分類學(xué)層次分布,；顯著差異物種LDA值分布柱狀圖，LDA分?jǐn)?shù)表示不同樣本之間的分化程度,，柱形的長(zhǎng)度為有顯著差異的微生物類群線通過性回歸分析得到的分值,，用以展示每個(gè)樣品內(nèi)顯著富集的物種及其重要性程度，設(shè)置LDA閾值為2,，在不同組的細(xì)菌中共鑒定出3個(gè)差異類群(P < 0.05),，其中魏斯氏菌屬（Weissella）在培菌第0天的樣品中豐度顯著高于其他組，可作為Mix_0的生物標(biāo)志物,。魏斯氏菌屬和乳桿菌是大曲中檢測(cè)出的典型乳酸菌類,，能夠以乳酸為底物進(jìn)行酯化反應(yīng),，酯化生成的乳酸乙酯與大曲的風(fēng)味的形成有關(guān)，同時(shí)也是酸度增加的原因之一,。真菌中共鑒定出11個(gè)差異類群,，鐮刀菌屬（Fusarium）和擲孢酵母屬是Mix_0中具有代表性的差異真菌屬，而散囊菌目（Eurotiomycetes）在培菌第27天的大曲中相對(duì)豐度最高,。培菌第0天的

大曲樣品是指剛制作完成入倉的曲塊,，聚集了來源于原料和制作環(huán)境的微生物，未經(jīng)高溫篩選的菌群可能呈現(xiàn)出更為豐富的狀態(tài),。

圖3-2 基于LEfSe分析不同培菌階段大曲微生物的生物標(biāo)志物

注：細(xì)菌(a)和真菌(c)的物種分類學(xué)分枝圖,；細(xì)菌(b)和真菌(d)的顯著差異物種LDA值分布柱狀圖(LDA > 2, P < 0.05)；分枝圖中的空心節(jié)點(diǎn)代表組間差異不顯著的分類單元,，而其它顏色節(jié)點(diǎn)則表明這些分類單元體現(xiàn)出顯著的組間差異,，該分類單元最高等級(jí)的物種進(jìn)行陰影處理。

在以上基礎(chǔ)上,，參照微生物基因組數(shù)據(jù),，對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行菌群基因和功能單元組成的預(yù)測(cè)，首先對(duì)各組中不同分類的細(xì)菌和真菌通路進(jìn)行統(tǒng)計(jì),。細(xì)菌和真菌的功能通路主要集中在生物合成,、物質(zhì)的降解/利用/同化、前體代謝物和能量的產(chǎn)生,。獲得了樣品分組的通路豐度后,，進(jìn)一步使用分層的樣本代謝通路豐度表進(jìn)行通路的細(xì)菌（圖3-3）和真菌（圖3-4）物種組成分析。本研究目的在于對(duì)小麥源微生物的功能進(jìn)行預(yù)測(cè)和發(fā)掘,，因此根據(jù)各代謝通路中小麥樣品微生物的平均功能豐度和發(fā)酵過程中所有大曲樣品組微生物的平均功能豐度的差異倍數(shù)進(jìn)行篩選,，得到了差異倍數(shù)較大且與培菌過程相關(guān)的通路說明小麥源菌屬的潛在功能。

對(duì)于細(xì)菌,，Pantoea在多粘菌素耐藥性(PWY0-1338),、5’-磷酸吡哆醛生物合成(PYRIDOXSYN-PWY)、葡萄糖和葡萄糖-1-磷酸降解(GLUCOSE1PMETAB-PWY),、ADP-甘油-β-D-甘露庚糖合成(PWY0-1241)和蔗糖降解(PWY-5384)途徑中發(fā)揮更重要的作用,，Pantoea在小麥和培菌初期的大曲中相對(duì)豐度更高，是小麥源功能微生物的重要代表之一參與大曲菌群組裝,。小麥攜帶的Pantoea可能來源于種植環(huán)境的水和土壤,，研究指出其具有修復(fù)和降解農(nóng)殘和有毒物質(zhì)的潛力，作為植物內(nèi)生菌,，還有固氮和促生的功能,，從功能預(yù)測(cè)的角度，我們也發(fā)現(xiàn)了其具有葡萄糖和蔗糖降解的潛力,，這些代謝功能與發(fā)酵過程密切相關(guān),，但泛菌屬在多大程度參與這些代謝以及具體的代謝機(jī)理還有待深究[108]。從真菌的代謝通路物種組成來看,，小麥源微生物在L-酪氨酸降解(TYRFUMCAT-PWY),、5-氨基咪唑核糖核苷酸生物合成(PWY-6121)、L-色氨酸降解為2-氨基-3-羧基粘多糖半醛(PWY-5651),、嘧啶核苷回收的超級(jí)途徑(PWY-7196),、嘌呤核苷酸補(bǔ)救的超級(jí)途徑(PWY66-409)和L-蛋氨酸生物合成III(HSERMETANA-PWY)中功能豐度優(yōu)勢(shì)明顯，其中鏈格孢屬和球腔菌屬對(duì)5-氨基咪唑核糖核苷酸生物合成貢獻(xiàn)最大,，而擲孢酵母屬與L-色氨酸降解有關(guān),。以上在分析了小麥中的標(biāo)志微生物的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步預(yù)測(cè)了小麥微生物突出的代謝功能,，這有助于系統(tǒng)全面地了解小麥源微生物在培菌過程中的作用和發(fā)揮作用的機(jī)制,。

圖3-3 關(guān)鍵代謝途徑的細(xì)菌群落組成

注：標(biāo)簽a、b,、c,、d和e展示了不同的代謝通路；

橫坐標(biāo)為樣本分組標(biāo)簽,；縱坐標(biāo)為相關(guān)代謝通路的相對(duì)豐度,；以不同顏色分層展示屬水平下不同分類單元對(duì)該代謝通路的貢獻(xiàn)值比例

圖3-4關(guān)鍵代謝途徑的真菌群落組成

3.4 制曲培菌過程中揮發(fā)性代謝物譜及差異分析

GC-IMS指紋圖譜詳細(xì)地展示了每個(gè)樣品中物質(zhì)的豐度和每種物質(zhì)在不同樣品中分布的差異如圖4-1所示，a圖的指紋圖譜中,，每一列代表一個(gè)樣品中選取的全部信號(hào)峰,，每一行代表同一揮發(fā)性物質(zhì)在不同樣品中的信號(hào)峰，顏色越亮代表物質(zhì)相對(duì)含量越高,，數(shù)字標(biāo)簽代表遷移譜庫中未定性的物質(zhì),。結(jié)果顯示我們?cè)谛←満痛笄鷺悠分泄矙z測(cè)到81個(gè)信號(hào)峰，其中對(duì)比數(shù)據(jù)庫共鑒定到29種化合物,，其中一些VOCs同時(shí)以單體和二聚體的形式存在,，保留時(shí)間相似，但漂移時(shí)間不同,，形成不同信號(hào),。小麥和培菌第0天的大曲樣品VOCs組成總體相似，區(qū)域A代表二者的特征化合物包括水芹烯,、2-庚酮和己醛,，水芹烯是一種重要的功能因子，是多種揮發(fā)性油中的天然成分,，可作為香料,，還可以作為生物活性殺蟲劑，這對(duì)大曲風(fēng)味的生成和預(yù)防蟲害有一定的作用,。培菌第4天時(shí),，一些物質(zhì)包括3-辛醇,、2-乙酰基-1-吡咯啉,、苯甲醛,、己酸乙酯、2-甲基-3-呋喃硫醇,、2-甲基丁酸乙酯和乙偶姻等含量明顯升高,。如區(qū)域C所示，培菌的第7到15天是VOCs大量形成的關(guān)鍵時(shí)期,，而第27天之后,，區(qū)域C內(nèi)的物質(zhì)相對(duì)含量明顯減少，3-甲基丁醛,、2-甲基丁醛和甲基丙醛成為培菌后期的代表性物質(zhì),。PLS-DA圖展示了有監(jiān)督的樣品聚類情況，說明不同階段的大曲樣品組之間有較明顯的代謝物積累差異,，基于此模型篩選出了15種VIP > 1的差異代謝物如c圖所示,。

圖4-1 小麥和大曲中的揮發(fā)性代謝物譜

a：揮發(fā)性代謝物的指紋圖譜；b：不同組樣品中揮發(fā)性代謝物的PLS-DA分析,；c：基于PLS-DA模型篩選差異代謝物(VIP > 1)

3.5大曲培菌過程中非揮發(fā)性代謝物譜及差異分析

為了更全面展示小麥和大曲中代謝物的積累,，本項(xiàng)目通過1H NMR對(duì)水溶性小分子代謝物進(jìn)行了測(cè)定，共檢測(cè)到200多種物質(zhì),，主要是糖類,、氨基酸及其衍生物、酸類,、醇類和酯類等,，結(jié)果如圖5-1所示。對(duì)所有測(cè)到的物質(zhì)進(jìn)行降維處理,，以PLS-DA模型下VIP值>1篩選得到了42個(gè)組間差異明顯的non-VOCs,，包括6種糖類、9種酸類,、16種氨基酸及其衍生物,、7種醇類以及4種其他物質(zhì)（圖5-2）。如結(jié)果所示,，磨碎的小麥樣品中富含葡萄糖,、甘露糖、核糖和果糖,。葡萄糖含量在前4天增加了2倍以上,，并在培菌初期保持在較高水平。小麥中果糖含量高于大曲樣品，甘露糖含量在培菌過程中緩慢增加然后稍有下降,，而核糖含量主要在培菌后期增加,。小麥中的乳酸、甲酸,、乙酸,、檸檬酸、2-羥基戊二酸鹽,、葡糖二酸鹽、琥珀酸鹽和其它酸類較少,。其中,，乳酸含量在培菌初期明顯增加，第12天積累最多,。乙酸含量的變化趨勢(shì)與乳酸相似,。從培菌初期開始，乙酸的含量急劇增加,，在第4天達(dá)到高峰,，然后下降到一個(gè)較低的水平,，并一直維持到末期,。不同的是，甲酸,、2-羥基戊二酸鹽和琥珀酸鹽的含量在前期較低,，中后期較高。甘露醇和赤蘚糖醇在培菌過程中呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì),，峰值出現(xiàn)在第27天,。木糖醇和D-蘇糖醇含量在前4天增加，然后保持相對(duì)穩(wěn)定,。第4天丙二醇含量明顯高于其他時(shí)間點(diǎn),，后期逐漸升高。乙醇含量在第12天至第15天展示出較高水平,，但在早期和后期較低,。小麥中O-磷酸絲氨酸的含量高于大曲樣品中的含量。大曲富含脯氨酸,、亮氨酸,、焦谷氨酸和絲氨酸。異亮氨酸和丙氨酸含量變化不明顯,，而4-羧基谷氨酸含量波動(dòng)較大,。總之,，幾乎所有non-VOCs含量在培菌前4天都呈現(xiàn)急劇上升的趨勢(shì),。大部分酸類,、醇類和氨基酸類的含量在隨后的過程中沒有明顯變化，而糖類尤其是還原糖的含量在中后期急劇下降,。小麥經(jīng)過微生物分解產(chǎn)生的糖類,、氨基酸類和酸類等是高溫大曲特征風(fēng)味的前體物質(zhì)。

圖5-1通過1H NMR檢測(cè)到的小麥和大曲中的物質(zhì)組成

注：不同字母標(biāo)注代表每種物質(zhì)類別在不同組之間具有顯著性差異(Duncan檢驗(yàn),，P < 0.05)

圖5-2 1H NMR鑒定出的小麥和大曲中的差異代謝物

注：通過PLS-DA篩選差異物質(zhì),，顯示了VIP > 1的糖類、酸類,、氨基酸及其衍生物,、醇類和其他物質(zhì)

3.6 微生物和代謝物的相關(guān)性分析

進(jìn)一步將細(xì)菌微生物組和代謝組進(jìn)行相關(guān)性分析，可以更直觀地預(yù)測(cè)并理解微生物與代謝物的相關(guān)性,，如圖6-1所示,。葡萄球菌屬（Staphylococcus）和泛菌屬（Pantoea）與果糖產(chǎn)量呈正相關(guān)，與焦谷氨酸產(chǎn)量呈負(fù)相關(guān),，葡萄球菌屬還與一些non-VOCs如蘇糖酸鹽和檸康酸鹽呈負(fù)相關(guān)作用,，而泛菌屬與一些VOCs呈負(fù)相關(guān)，如1-辛烯-3-酮,、2-甲基丁醛和苯乙醛,。嗜熱放線菌屬（Thermoactinomyces）與果糖含量有負(fù)相關(guān)作用，對(duì)甘露醇,、赤蘚糖醇,、琥珀酸、焦谷氨酸和檸康酸有正向促進(jìn)作用,，嗜熱放線菌屬可以分泌蛋白酶,、淀粉酶、纖維素酶,、葡萄糖淀粉酶等水解蛋白質(zhì)和淀粉,，代謝產(chǎn)生VOCs[118]。糖多孢菌屬（Saccharopolyspora）與一些VOCs包括1-辛烯-3-酮,、2-甲基丁醛二聚體,、3-甲基丁醛二聚體和苯乙醛單體之間存在正相關(guān)關(guān)系。整體來看,，嗜熱放線菌屬和葡萄球菌屬與大部分non-VOCs的相關(guān)性趨勢(shì)相反,，而泛菌屬（Pantoea）和糖多孢菌屬（Saccharopolyspora）與VOCs的相關(guān)性相反。

圖6-1 Spearman秩相關(guān)檢驗(yàn)的微生物與代謝物相關(guān)性熱圖

a：細(xì)菌和非揮發(fā)性有機(jī)物,；b：細(xì)菌和揮發(fā)性有機(jī)化合物,；c：真菌和非揮發(fā)性有機(jī)物；d：真菌和揮發(fā)性有機(jī)化合物。上述微生物為細(xì)菌/真菌相對(duì)豐度排名前10的菌屬,，代謝產(chǎn)物為通過PLS-DA模型篩選的組間有顯著差異的揮發(fā)性物質(zhì)和非揮發(fā)性物質(zhì)(*表示P < 0.05,；**表示P < 0.01)

對(duì)于真菌和代謝物相關(guān)性作用，熱圖結(jié)果顯示嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）與眾多代謝物呈正相關(guān)作用,，其中包括3種醇(甘露醇,、赤蘚糖醇和阿拉伯糖醇)、3種醛(2-甲基丁醛二聚體,、3-甲基丁醛二聚體和苯乙醛單體),、3種酸(甲酸鹽、葡萄糖酸鹽和琥珀酸鹽)和2種氨基酸衍生物(焦谷氨酸鹽和谷氨酰胺),。Chromocleista與乳酸和亮氨酸呈強(qiáng)正相關(guān)作用(相關(guān)性系數(shù)絕對(duì)值大于0.8),，Alternaria和Mycosphaerella與一些氨基酸(脯氨酸和精氨酸)及其衍生物(焦谷氨酸和4-羧基谷氨酸)呈顯著負(fù)相關(guān)，而與果糖含量呈正相關(guān),。圖d可以看出Alternaria和Mycosphaerella與大多數(shù)差異性的VOCs展示出了相似的相關(guān)性作用，尤其是1-辛烯-3-酮單體,、2-甲基-丁醛和3-甲基丁醛二聚體,、甲基丙醛、苯乙醛單體和丙醛,。Millerozyma被預(yù)測(cè)與葡萄糖,、乳酸、乙酸,、亮氨酸和纈氨酸呈正相關(guān),，Rhizomucor和Lichtheimia的豐度與乙酸鹽呈正相關(guān)，Alternaria,、Mycosphaerella和Aspergillus這三個(gè)真菌屬與代謝產(chǎn)物的相關(guān)性趨勢(shì)相似,，而Thermoascus與它們的相關(guān)性趨勢(shì)幾乎相反。

細(xì)菌和真菌豐度優(yōu)勢(shì)菌屬和代謝物的相關(guān)性分析表明高溫放線菌屬和葡萄球菌屬與大多數(shù)非揮發(fā)性代謝物的相關(guān)性趨勢(shì)相反,，而泛菌屬和糖多孢菌屬與揮發(fā)性代謝物的相關(guān)性作用相反,。鏈格孢菌屬、小球殼菌屬和曲霉菌屬與代謝產(chǎn)物的相關(guān)性趨勢(shì)相似,，而嗜熱子囊菌屬與它們的相關(guān)性趨勢(shì)幾乎相反,。以上關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)分析全面展示了大曲培菌過程中多組學(xué)之間的關(guān)聯(lián)性，為后續(xù)菌群的功能驗(yàn)證提供了思路和方向,。

3.7模擬培菌解析小麥源菌群的代謝特征

本部分研究是在實(shí)驗(yàn)室水平下,，模擬車間高溫大曲的制曲培菌過程，設(shè)置相同的培菌溫度,，以是否將小麥源微生物進(jìn)行滅菌處理為變量,，比較對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組培菌過程中可培養(yǎng)微生物數(shù)量、群落演替、代謝物積累和代謝通路表達(dá)的差異,，全面直觀地闡述小麥源微生物在培菌過程中的功能作用,，并篩選其中發(fā)揮最關(guān)鍵功能的小麥源核心菌屬，發(fā)掘核心微生物的代謝功能,，旨在從控制微生物的角度優(yōu)選原料,，調(diào)節(jié)和優(yōu)化高溫大曲培菌過程。

對(duì)兩組模擬培菌的大曲樣品的可培養(yǎng)微生物數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,，結(jié)果顯示,，在模擬培菌初期，不做任何處理（MOE）組的需氧菌落總數(shù)顯著高于滅酶滅菌（MOE_inactivate）組,，耐熱菌生物量也呈現(xiàn)了相似的趨勢(shì),。從培菌第7天到結(jié)束，MOE和MOE_inactivate組中的可培養(yǎng)真菌數(shù)量都低于有效計(jì)數(shù)范圍,。在相同的培菌溫度下，實(shí)驗(yàn)室水平的模擬培菌可以獲得數(shù)量可觀的可培養(yǎng)細(xì)菌,，但真菌數(shù)量處于很低水平，因此我們認(rèn)為小麥源細(xì)菌在培菌過程中可能起著更重要的作用,，而真菌更可能來自制曲車間環(huán)境,。綜上，小麥源細(xì)菌應(yīng)該得到更多重視,。進(jìn)一步對(duì)兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組的微生物組和代謝物進(jìn)行解析和相關(guān)性分析,，高通量測(cè)序結(jié)果表明兩個(gè)培菌過程的細(xì)菌多樣性和群落結(jié)構(gòu)都有明顯差異，MOE組細(xì)菌的多樣性更高,，群落組成更豐富,，兩組中豐度最高的細(xì)菌均為芽孢桿菌屬。1H NMR結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析篩選出的兩組間的差異代謝物在MOE組中含量更高,，尤其是糖類和氨基酸類,，這些物質(zhì)主要在培菌的前4天快速積累，小麥源細(xì)菌在溫度驅(qū)動(dòng)下參與了這一階段菌群的劇烈演替和活躍的代謝活動(dòng),。

在以上結(jié)果基礎(chǔ)上,，本研究繼續(xù)從微生物多樣性的角度探討了兩組培菌特征差異的原因。使用細(xì)菌序列豐度前100的ASV構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹以分析細(xì)菌群落中的進(jìn)化關(guān)系,，,，50%左右的ASV注釋為Bacillus，且Bacillus在MOE_inactivate和MOE組的分布存在差異性,。這一結(jié)果佐證了Bacillus的異質(zhì)性是導(dǎo)致兩組培菌微生物群落演替和代謝差異的關(guān)鍵因素,。此外,，結(jié)合培菌前期糖類和氨基酸類的快速積累這一特征，下一步以Bacillus菌屬為關(guān)鍵研究對(duì)象,，小麥源微生物參與的糖和氨基酸代謝為關(guān)鍵代謝過程進(jìn)行更深入的討論,。

MOE_inactivate組和MOE組通過PLS-DA模型的VIP值篩選的差異代謝物的代謝通路富集和功能預(yù)測(cè)情況如圖7-1所示，差異代謝物與氨酰tRNA生物合成,，D-谷氨酰胺和D-谷氨酸鹽代謝,，纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成,，氮代謝,，半乳糖代謝，丙氨酸,、天冬氨酸和谷氨酸鹽代謝,，纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解,，精氨酸生物合成等顯著相關(guān),。根據(jù)通路的富集情況，氨基酸類和糖類相關(guān)的代謝對(duì)不同培菌組的培菌特征差異有重要影響,，因此進(jìn)一步詳細(xì)展示了纈氨酸,、亮氨酸、異亮氨酸生物合成,，半乳糖代謝，丙氨酸,、天冬氨酸,、谷氨酸代謝，纈氨酸,、亮氨酸,、異亮氨酸降解，精氨酸生物合成,，淀粉和蔗糖代謝6條重要代謝途徑如b圖所示,。代謝途徑中的差異代謝產(chǎn)物包括氨基酸和糖分別用藍(lán)色和紅色字體標(biāo)記，MOE組的L-異亮氨酸,、L-纈氨酸,、L-亮氨酸、谷氨酰胺,、D-甘露糖,、α-D-葡萄糖-1P、D-葡萄糖含量均高于MOE_inactivate組,，這些物質(zhì)多在培菌早期快速積累,。

在明確了差異菌屬和差異代謝通路之后,，本研究繼續(xù)探索了Bacillus和糖代謝、氨基酸代謝之間的關(guān)聯(lián)性,。通過PICRUSt2預(yù)測(cè)了模擬培菌過程中Bacillus的基因組功能,，選擇所有注釋到Bacillus的ASV進(jìn)行糖和氨基酸代謝相關(guān)的功能預(yù)測(cè)，并通過微生物的功能豐度和差異倍數(shù)展示差異性（圖7-2）,?？傮w而言，培菌結(jié)束時(shí)MOE組Bacillus的糖和氨基酸代謝相關(guān)的代謝通路豐度高于MOE_inactivate組,，涉及到的氨基酸代謝通路有14個(gè),，糖代謝通路有15個(gè)，其中差異倍數(shù)最大的通路分別是組氨酸代謝和磷酸肌醇代謝,。

圖7-1 高溫大曲模擬培菌過程中代謝產(chǎn)物功能分析

a：代謝通路富集概況氣泡圖,；b：關(guān)鍵的差異代謝途徑和涉及到的差異代謝物(糖類和氨基酸類)

圖7-2 Bacillus在MOE_inactivate和MOE培菌組中的功能預(yù)測(cè)

a：模擬培菌結(jié)束時(shí)Bacillus的糖代謝和氨基酸代謝的功能豐度；b：組氨酸和磷酸肌醇代謝相關(guān)的酶功能注釋的相對(duì)豐度熱圖,；c：酶注釋的序列16S rRNA基因拷貝數(shù)的單因素方差分析比較,，*代表P < 0.05

小麥源微生物影響高溫大曲菌群的組裝尤其在培菌早期階段，提供了豐富的代謝物和風(fēng)味前體物質(zhì)調(diào)控群落演替,，以前的研究已表明大曲中的細(xì)菌主要來源于原料,，真菌來源于制曲環(huán)境。在本研究中,，我們分別使用滅菌的小麥(MOE_inactivate)和未作處理的小麥(MOE)分別進(jìn)行模擬培菌,，同時(shí)檢測(cè)培菌過程中兩組微生物和代謝物譜的差異?？膳囵B(yǎng)微生物計(jì)數(shù)結(jié)果表明小麥在培菌初期提供了更多細(xì)菌,，隨著培菌的進(jìn)行，小麥源細(xì)菌發(fā)揮了更明顯的作用,，這和以前的結(jié)果一致,。培菌過程中，Bacillus是兩組中的豐度最高的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌,，通過構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹表明Bacillus的異質(zhì)性是菌群差異性的集中體現(xiàn),。

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成果表達(dá)

4.1 已發(fā)表文章

ü Zhang Y D, Shen Y, Cheng W, Wang X, Xue Y S, Chen X X, Han B Z. Understanding the shifts of microbial community and metabolite profile from wheat to mature Daqu[J]. Frontiers in Microbiology, 2021, 12: 714726.

ü Zhang Y D, Xu J G, Ding F, Deng W Y, Wang X, Xue Y S, Chen X X, Han B Z. Multidimensional profiling indicates the shifts and functionality of wheat-origin microbiota during high-temperature Daqu incubation[J]. Food Research International, 2022, 156: 111191.6

ü Zhang Y D, Xu J G, Jiang Y L, Niu J, Chen X X, Han B Z. Microbial characteristics and metabolite profiles of high-temperature Daqu in different maturation stages[J]. World Journal of Microbiology & Biotechnology, 2022, 38(12): 234.

ü Zhang Y D, Shen Y, Niu J, Ding F, Ren Y, Chen X X, Han B Z. Bacteria‐induced amino acid metabolism involved in appearance characteristics of high‐temperature Daqu[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2022, 103(1): 243-254.

ü Zhang Y D, Ding F, Shen Y, Cheng W, Xue Y S, Han B Z, Chen X X. Characteristics of the microbiota and metabolic profile of high-temperature Daqu with different grades. World Journal of Microbiology & Biotechnology, 2022, 38(8), 137.

ü 張?jiān)E, 沈毅, 程偉, 薛巖松, 陳小雪, 韓北忠. 三代全長(zhǎng)高通量測(cè)序分析新稻草和陳稻草的微生物特征[J]. 中國釀造, 2022, 41(09): 24-30.

ü 張?jiān)E, 陳小雪, 吳鵬, 史利霞, 韓北忠. 多組學(xué)分析眾麥1號(hào)和糯麥116兩種制曲小麥的特征[J]. 中國釀造, 2023, 42(02): 32-39.

ü 丁芳, 張?jiān)E, 蔣英麗, 陳波, 陳小雪, 韓北忠. 不同等級(jí)高溫大曲微生物群落和代謝物的特征分析[J]. 中國釀造, 2022, 41(11): 24-30.

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行業(yè)效益與人才培養(yǎng)

目前白酒行業(yè)內(nèi)普遍存在大曲品質(zhì)不穩(wěn)定的問題。已有研究表明制曲原料對(duì)大曲的品質(zhì)有重要影響,，小麥源微生物對(duì)高溫大曲菌群有重要貢獻(xiàn),，因此從原料微生物的角度著手，揭示原料微生物在發(fā)酵過程中的遷移規(guī)律和作用機(jī)制,，有利于對(duì)大曲微生物菌群的形成進(jìn)行干預(yù),，從而提高大曲品質(zhì)，在此基礎(chǔ)上,，錨定制曲過程中的核心功能微生物菌群,，用標(biāo)準(zhǔn)化的手段來規(guī)范傳統(tǒng)工藝,，保證白酒的產(chǎn)量和質(zhì)量，也為固態(tài)發(fā)酵過程由“經(jīng)驗(yàn)型”控制向“科技型”控制轉(zhuǎn)變奠定了基礎(chǔ),。

共培養(yǎng)博士研究生1名和碩士研究生2名,。

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下一步研究計(jì)劃

強(qiáng)化接種是驗(yàn)證功能菌株特性的有效手段，已有很多研究通過篩選菌株和強(qiáng)化接種來調(diào)節(jié)發(fā)酵系統(tǒng)中微生物群落的代謝活動(dòng),，達(dá)到改良發(fā)酵產(chǎn)品的風(fēng)味的目的,。下一步研究的主要內(nèi)容是分離、純化和鑒定小麥源芽孢桿菌菌株,，通過環(huán)境耐受性測(cè)試和產(chǎn)酶活力篩選發(fā)酵性能優(yōu)良的部分進(jìn)行強(qiáng)化接種實(shí)驗(yàn),，通過1H NMR、LC-MS和氨基酸分析儀檢測(cè)了功能菌株單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)發(fā)酵液中和強(qiáng)化大曲樣品中的糖和氨基酸物質(zhì)的含量,，表征功能菌株參與糖代謝和氨基酸代謝的特征,，同時(shí)通過擴(kuò)增子測(cè)序和生信分析展示了強(qiáng)化接種對(duì)大曲菌群的擾動(dòng)作用，最后通過多組學(xué)聯(lián)合分析闡明了菌株參與的關(guān)鍵代謝通路,。