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中國白酒技術創(chuàng)新戰(zhàn)略發(fā)展委員會第四期科研項目匯報(2023年)

課題名稱:小麥源微生物在高溫大曲制曲過程中的遷移規(guī)律和作用機制



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立項背景


“曲為酒之骨”,大曲作為白酒糖化發(fā)酵劑歷史悠久,,至今仍具有無法替代的作用,。其制作過程通常采用開放式的自然接種形式,原料和環(huán)境微生物的參與形成了復雜獨特的微生物群落,對于白酒獨特風味和品質的形成具有重要意義。通過網羅原料和環(huán)境微生物的多菌種混合發(fā)酵是高溫大曲制作過程的典型特征,,以小麥為原料的固態(tài)基質既是微生物的營養(yǎng)源也是重要的生長微環(huán)境,。目前,,主要依靠經驗控制的制曲工藝是制約大曲品質穩(wěn)定性和生產標準化的主要問題。


原料是保證大曲微生物組形成和質量穩(wěn)定性的關鍵因素。原料源微生物菌群在制曲過程中微生物組的組裝和風味物質的形成至關重要。葡萄球菌是重要的芳香化合物生產者,,乳酸菌產生的乳酸是乳酸乙酯形成的前體物質,,芽孢桿菌是大曲中淀粉酶,、蛋白酶和脂肪酶的重要貢獻者,。原料中的功能微生物能夠驅動制曲過程中微生物群落的演替,。通過構建關聯(lián)網絡觀測優(yōu)勢小麥源微生物在大曲菌群中的生態(tài)位作用有利于制曲過程中功能微生物的篩選。制曲過程涉及到微生物富集,、初級和次級代謝,,富集的微生物進一步相互作用,形成平衡穩(wěn)定的混合菌群,,經過一系列復雜的演替過程,,最終在白酒釀造過程中發(fā)揮作用,。


近年來,研究人員采用多種方法,,如利用傳統(tǒng)培養(yǎng)法對可培養(yǎng)微生物進行分離純化,,利用分子生物學方法對不可培養(yǎng)微生物進行鑒定等對不同類型大曲的微生物多樣性進行研究,得到了一些大曲微生物多樣性以及微生物群落結構演替規(guī)律的結論,。但原料源功能微生物在制曲過程中的遷移演變規(guī)律及其對大曲功能及品質特征的影響尚不清楚,?;诖?,本項目擬采用高通量測序技術和傳統(tǒng)培養(yǎng)法追蹤高溫大曲制曲過程中微生物群落演替并挖掘發(fā)酵過程中的原料源功能微生物,進一步借助宏代謝組學技術分析制曲過程中的特征風味物質和非揮發(fā)性代謝物的變化,,闡明原料源功能微生物在制曲過程中的遷移規(guī)律及其對大曲風味代謝功能的調控作用,,基于菌系、物系和酶系多層面揭示原料源功能微生物在強化大曲中的應用潛力,,為建立原料選用標準和提高大曲品質奠定理論基礎,,也為實現(xiàn)傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵工業(yè)化和標準化提供技術支持,。


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主要研究內容

2.1 制曲過程中微生物群落組成分析


采集小麥和制曲過程中不同階段的大曲樣本,,并對其微生物進行傳統(tǒng)培養(yǎng)法和高通量測序結合分析,。通過擴增子測序技術測定原料和大曲菌群結構,,并進行對比和溯源分析,綜合分析制曲過程中菌群和代謝功能的動態(tài)變化,,明確制曲過程中微生物遷移規(guī)律,。


2.2 制曲過程中的風味物質和代謝物變化分析


制曲過程中的大曲樣本同時進行風味物質和非揮發(fā)性代謝物的分析,結合微生物分析結果進行關聯(lián)網絡分析,,挖掘重要微生物的代謝特征,,表征微生物與風味物質之間的關系,,討論微生物在制曲過程中的代謝功能,,從更客觀的角度闡明小麥源微生物對大曲菌群和風味物質的貢獻,。


2.3 小麥源功能微生物的篩選及其在強化大曲中的作用


結合已有對高溫大曲中純培養(yǎng)小麥源微生物功能的研究結果以及群落的結構分析結果,,尋找對高溫大曲群落貢獻較大的微生物。測定菌株環(huán)境耐受性和產酶活性,,篩選得到小麥源功能微生物,。通過模擬大曲固態(tài)發(fā)酵體系,,探索外源添加小麥源功能微生物對大曲微生物群落組成、代謝物譜和釀酒功能特性的影響,,進而闡明小麥源微生物對于高溫大曲的重要意義,。


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研究結果


3.1 小麥和大曲中的可培養(yǎng)微生物計數


采集制曲原料小麥和制曲培菌第0、4,、7,、12、15,、27,、40天的過程曲樣品進行可培養(yǎng)微生物計數,結果如圖1-1所示,。小麥攜帶著一定數量的細菌和真菌,,參與到大曲微生物群落的初始組裝,之后可培養(yǎng)微生物的數量呈現(xiàn)一定的波動變化,,需氧菌落總數,、耐熱菌數、乳酸菌和真菌的數量均在培菌前4天有明顯的上升趨勢并在第4天達到峰值,。剛入倉時曲塊核心溫度上升緩慢,,濕度大,適宜微生物的生長,,此階段以培養(yǎng)霉菌和富集酶系為主,。培菌第7天,進行第一次人工翻曲以調節(jié)不同位置曲塊的溫度和濕度相對均勻,,此時可培養(yǎng)微生物數量有明顯的下降趨勢,,之后溫度又逐漸攀升,有利于耐熱菌尤其是芽孢桿菌的生長繁殖,,而霉菌的生長此后逐漸受到抑制,,乳酸菌的耐熱性也較差因此數量也有所減少。第40天培菌結束時,,需氧菌落總數,、耐熱菌數、乳酸菌和真菌數量分別達到了7.56,、6.62,、4.50和4.60 log CFU/g。


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圖1-1 小麥和大曲中可培養(yǎng)微生物數量

注:Wheat,,小麥樣品,;Mix_n,培菌第n天的大曲樣品,;Total aerobic bacteria,,需氧菌落總數,;Thermotolerant bacteria,耐熱菌數,;Lactic bacteria,,乳酸菌,F(xiàn)ungi 真菌,。不同字母標注代表具有顯著性差異(Duncan檢驗,,P < 0.05)


3.2 小麥和大曲微生物群落結構分析


在分析不同樣品微生物多樣性差異的基礎上,進一步對小麥和大曲微生物群落結構進行探討,。首先通過Krona物種組成圖將不同分類學水平小麥源細菌的組成進行可視化展示,,如圖2-1 (a)所示。小麥中細菌門水平以變形菌門(Proteobacteria)和厚壁菌門(Firmicutes)為主,,總占比超過80%,,其中厚壁菌門主要以葡萄球菌屬(Staphylococcus)為主。變形菌門中主要是泛菌屬(Pantoea),,假單胞菌屬(Pseudomonas),,博克氏菌屬(Burkholderia)和馬賽菌屬(Massilia)。PacBio SMRT測序提高了微生物種水平的鑒定能力,,在小麥中檢出了相對豐度分別為15.00%的唐菖蒲伯克霍爾德菌(Burkholderia gladioli),,9.65%的金色馬賽菌(Massilia aurea)和5.09%的松鼠葡萄球菌(Staphylococcus sciuri)。唐菖蒲伯克霍爾德菌是一種植物病原菌,,常常導致谷類等腐爛,,目前關于其在大曲中的發(fā)酵特性還未明確,啟示我們要密切關注一些植物病原菌,,對原料質量嚴格把控,,預防由植物病原菌引起的大曲品質下降。


小麥微生物的真菌結構如圖2-1 (b)所示,,子囊菌門(Ascomycota)豐度為64.34%,,其次為擔子菌門(Basidiomycota)(3.64%)。在屬水平,,鏈格孢屬(Alternaria)和球腔菌屬(Mycosphaerella)是豐度最優(yōu)勢的菌屬,,分別占比41.55%和17.12%,進一步種水平的鑒定結果表明鏈格孢屬幾乎全為Alternaria eichhorniae,,而球腔菌屬則均檢出為Mycosphaerella tassiana,。擔子菌門中的真菌幾乎全部為擲孢酵母屬(Sporobolomyces)屬的Sporobolomyces roseus。


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圖2-1 通過Krona可視化小麥源微生物群落結構


進一步,,圖2-2展示了更為詳細的不同分類學水平細菌和真菌的組成情況,。就細菌而言,厚壁菌門在整個培菌過程中均為豐度最優(yōu)勢的微生物,,在培菌第4天時相對豐度達到最高,,超過90%,隨后呈波動下降趨勢且豐度始終高于50%,。變形菌門同樣存在于培菌始末,,相對豐度受溫度影響較明顯,波動較為劇烈,。以上二者在小麥源細菌中總占比超過80%,,說明小麥源細菌和培菌過程大曲的細菌輪廓具有一定相似性。在屬水平,,小麥源細菌和培菌初期大曲細菌組成較為相似,,但與中后期過程曲菌群差異較大,尤其體現(xiàn)在高溫放線菌屬(Thermoactinomyces)和芽孢菌屬(Bacillus),。對于真菌,,小麥和大曲豐度最高的皆為子囊菌門(Ascomycota),子囊菌門在高溫大曲培菌過程中優(yōu)勢明顯,,從第7天開始相對豐度保持在90%以上,。在屬水平,小麥為大曲發(fā)酵提供了豐富的鏈格孢屬和一定豐度的曲霉菌屬(Aspergillus),,從培菌中期開始嗜熱子囊菌屬(Thermoascus)占據豐度優(yōu)勢并持續(xù)到培菌結束,。


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圖2-2 小麥和大曲樣品中不同分類學水平微生物的相對豐度(結果以組內均值展示)

注:柱狀圖展示了門水平細菌(a)和真菌(b)群落組成;Circos圖展示了屬水平細菌(c)和真菌(d)組成,;氣泡圖展示了種水平細菌(e)和真菌(f)組成,。


3.3 標志微生物的挖掘和微生物功能預測


使用ASV豐度表制作的韋恩圖,展示了不同組間共有和特有的ASV個數如圖3-1所示,,無論是細菌還是真菌,,都不存在所有樣品共ASV,這說明培菌過程中菌群發(fā)生了劇烈的演替,,小麥和培菌初始階段大曲樣品中的特有真菌ASV數目遠多于中后期大曲樣品,。


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圖3-1 小麥和大曲中細菌(a)和真菌(b)韋恩圖


在韋恩圖的基礎上,LEfSe分析直接對所有分類水平同時進行差異分析,,強調尋找培菌過程中不同分組之間穩(wěn)健的差異物種,,即標志物種(biomarker),且篩選在不同子分組中表現(xiàn)一致的差異微生物類群,。這部分研究的目的更傾向于探尋培菌過程中的菌群演替規(guī)律和不同階段的菌群特征,,因此區(qū)別于上述韋恩圖展示的結果。LEfSe分析所展示的物種分類學分枝圖和LDA柱狀圖剔除了小麥樣本,,將研究對象集中于培菌過程的大曲,。如圖3-2所示,LEfSe分析結果包括兩部分,,分別為物種分類學分枝圖,,用以展示在各組樣品中標志物種的分類學層次分布,;顯著差異物種LDA值分布柱狀圖,LDA分數表示不同樣本之間的分化程度,,柱形的長度為有顯著差異的微生物類群線通過性回歸分析得到的分值,,用以展示每個樣品內顯著富集的物種及其重要性程度,設置LDA閾值為2,,在不同組的細菌中共鑒定出3個差異類群(P < 0.05),,其中魏斯氏菌屬(Weissella)在培菌第0天的樣品中豐度顯著高于其他組,可作為Mix_0的生物標志物,。魏斯氏菌屬和乳桿菌是大曲中檢測出的典型乳酸菌類,,能夠以乳酸為底物進行酯化反應,酯化生成的乳酸乙酯與大曲的風味的形成有關,,同時也是酸度增加的原因之一,。真菌中共鑒定出11個差異類群,鐮刀菌屬(Fusarium)和擲孢酵母屬是Mix_0中具有代表性的差異真菌屬,,而散囊菌目(Eurotiomycetes)在培菌第27天的大曲中相對豐度最高,。培菌第0天的


大曲樣品是指剛制作完成入倉的曲塊,聚集了來源于原料和制作環(huán)境的微生物,,未經高溫篩選的菌群可能呈現(xiàn)出更為豐富的狀態(tài),。


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圖3-2 基于LEfSe分析不同培菌階段大曲微生物的生物標志物

注:細菌(a)和真菌(c)的物種分類學分枝圖;細菌(b)和真菌(d)的顯著差異物種LDA值分布柱狀圖(LDA > 2, P < 0.05),;分枝圖中的空心節(jié)點代表組間差異不顯著的分類單元,,而其它顏色節(jié)點則表明這些分類單元體現(xiàn)出顯著的組間差異,該分類單元最高等級的物種進行陰影處理,。


在以上基礎上,,參照微生物基因組數據,對測序結果進行菌群基因和功能單元組成的預測,,首先對各組中不同分類的細菌和真菌通路進行統(tǒng)計,。細菌和真菌的功能通路主要集中在生物合成、物質的降解/利用/同化,、前體代謝物和能量的產生,。獲得了樣品分組的通路豐度后,進一步使用分層的樣本代謝通路豐度表進行通路的細菌(圖3-3)和真菌(圖3-4)物種組成分析,。本研究目的在于對小麥源微生物的功能進行預測和發(fā)掘,,因此根據各代謝通路中小麥樣品微生物的平均功能豐度和發(fā)酵過程中所有大曲樣品組微生物的平均功能豐度的差異倍數進行篩選,得到了差異倍數較大且與培菌過程相關的通路說明小麥源菌屬的潛在功能,。


對于細菌,,Pantoea在多粘菌素耐藥性(PWY0-1338)、5’-磷酸吡哆醛生物合成(PYRIDOXSYN-PWY)、葡萄糖和葡萄糖-1-磷酸降解(GLUCOSE1PMETAB-PWY),、ADP-甘油-β-D-甘露庚糖合成(PWY0-1241)和蔗糖降解(PWY-5384)途徑中發(fā)揮更重要的作用,,Pantoea在小麥和培菌初期的大曲中相對豐度更高,是小麥源功能微生物的重要代表之一參與大曲菌群組裝,。小麥攜帶的Pantoea可能來源于種植環(huán)境的水和土壤,,研究指出其具有修復和降解農殘和有毒物質的潛力,,作為植物內生菌,,還有固氮和促生的功能,,從功能預測的角度,,我們也發(fā)現(xiàn)了其具有葡萄糖和蔗糖降解的潛力,這些代謝功能與發(fā)酵過程密切相關,,但泛菌屬在多大程度參與這些代謝以及具體的代謝機理還有待深究[108],。從真菌的代謝通路物種組成來看,小麥源微生物在L-酪氨酸降解(TYRFUMCAT-PWY),、5-氨基咪唑核糖核苷酸生物合成(PWY-6121),、L-色氨酸降解為2-氨基-3-羧基粘多糖半醛(PWY-5651)、嘧啶核苷回收的超級途徑(PWY-7196),、嘌呤核苷酸補救的超級途徑(PWY66-409)和L-蛋氨酸生物合成III(HSERMETANA-PWY)中功能豐度優(yōu)勢明顯,,其中鏈格孢屬和球腔菌屬對5-氨基咪唑核糖核苷酸生物合成貢獻最大,而擲孢酵母屬與L-色氨酸降解有關,。以上在分析了小麥中的標志微生物的基礎上,,進一步預測了小麥微生物突出的代謝功能,這有助于系統(tǒng)全面地了解小麥源微生物在培菌過程中的作用和發(fā)揮作用的機制,。


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圖3-3 關鍵代謝途徑的細菌群落組成

注:標簽a,、b、c,、d和e展示了不同的代謝通路,;

橫坐標為樣本分組標簽;縱坐標為相關代謝通路的相對豐度,;以不同顏色分層展示屬水平下不同分類單元對該代謝通路的貢獻值比例


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圖3-4關鍵代謝途徑的真菌群落組成


3.4 制曲培菌過程中揮發(fā)性代謝物譜及差異分析


GC-IMS指紋圖譜詳細地展示了每個樣品中物質的豐度和每種物質在不同樣品中分布的差異如圖4-1所示,,a圖的指紋圖譜中,每一列代表一個樣品中選取的全部信號峰,,每一行代表同一揮發(fā)性物質在不同樣品中的信號峰,,顏色越亮代表物質相對含量越高,數字標簽代表遷移譜庫中未定性的物質,。結果顯示我們在小麥和大曲樣品中共檢測到81個信號峰,,其中對比數據庫共鑒定到29種化合物,其中一些VOCs同時以單體和二聚體的形式存在,保留時間相似,,但漂移時間不同,,形成不同信號,。小麥和培菌第0天的大曲樣品VOCs組成總體相似,,區(qū)域A代表二者的特征化合物包括水芹烯,、2-庚酮和己醛,水芹烯是一種重要的功能因子,是多種揮發(fā)性油中的天然成分,可作為香料,,還可以作為生物活性殺蟲劑,,這對大曲風味的生成和預防蟲害有一定的作用,。培菌第4天時,,一些物質包括3-辛醇,、2-乙?;?1-吡咯啉,、苯甲醛,、己酸乙酯,、2-甲基-3-呋喃硫醇,、2-甲基丁酸乙酯和乙偶姻等含量明顯升高。如區(qū)域C所示,,培菌的第7到15天是VOCs大量形成的關鍵時期,,而第27天之后,,區(qū)域C內的物質相對含量明顯減少,,3-甲基丁醛,、2-甲基丁醛和甲基丙醛成為培菌后期的代表性物質,。PLS-DA圖展示了有監(jiān)督的樣品聚類情況,說明不同階段的大曲樣品組之間有較明顯的代謝物積累差異,,基于此模型篩選出了15種VIP > 1的差異代謝物如c圖所示,。


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圖4-1 小麥和大曲中的揮發(fā)性代謝物譜

a:揮發(fā)性代謝物的指紋圖譜,;b:不同組樣品中揮發(fā)性代謝物的PLS-DA分析;c:基于PLS-DA模型篩選差異代謝物(VIP > 1)


3.5大曲培菌過程中非揮發(fā)性代謝物譜及差異分析


為了更全面展示小麥和大曲中代謝物的積累,本項目通過1H NMR對水溶性小分子代謝物進行了測定,,共檢測到200多種物質,主要是糖類、氨基酸及其衍生物、酸類,、醇類和酯類等,,結果如圖5-1所示,。對所有測到的物質進行降維處理,,以PLS-DA模型下VIP值>1篩選得到了42個組間差異明顯的non-VOCs,,包括6種糖類、9種酸類,、16種氨基酸及其衍生物,、7種醇類以及4種其他物質(圖5-2),。如結果所示,,磨碎的小麥樣品中富含葡萄糖、甘露糖,、核糖和果糖,。葡萄糖含量在前4天增加了2倍以上,并在培菌初期保持在較高水平,。小麥中果糖含量高于大曲樣品,,甘露糖含量在培菌過程中緩慢增加然后稍有下降,而核糖含量主要在培菌后期增加,。小麥中的乳酸,、甲酸、乙酸,、檸檬酸,、2-羥基戊二酸鹽、葡糖二酸鹽,、琥珀酸鹽和其它酸類較少。其中,,乳酸含量在培菌初期明顯增加,,第12天積累最多,。乙酸含量的變化趨勢與乳酸相似,。從培菌初期開始,,乙酸的含量急劇增加,在第4天達到高峰,,然后下降到一個較低的水平,,并一直維持到末期,。不同的是,甲酸,、2-羥基戊二酸鹽和琥珀酸鹽的含量在前期較低,,中后期較高。甘露醇和赤蘚糖醇在培菌過程中呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,,峰值出現(xiàn)在第27天,。木糖醇和D-蘇糖醇含量在前4天增加,然后保持相對穩(wěn)定,。第4天丙二醇含量明顯高于其他時間點,,后期逐漸升高。乙醇含量在第12天至第15天展示出較高水平,,但在早期和后期較低,。小麥中O-磷酸絲氨酸的含量高于大曲樣品中的含量。大曲富含脯氨酸,、亮氨酸,、焦谷氨酸和絲氨酸。異亮氨酸和丙氨酸含量變化不明顯,,而4-羧基谷氨酸含量波動較大,。總之,,幾乎所有non-VOCs含量在培菌前4天都呈現(xiàn)急劇上升的趨勢,。大部分酸類,、醇類和氨基酸類的含量在隨后的過程中沒有明顯變化,而糖類尤其是還原糖的含量在中后期急劇下降,。小麥經過微生物分解產生的糖類,、氨基酸類和酸類等是高溫大曲特征風味的前體物質,。


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圖5-1通過1H NMR檢測到的小麥和大曲中的物質組成

注:不同字母標注代表每種物質類別在不同組之間具有顯著性差異(Duncan檢驗,,P < 0.05)


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圖5-2 1H NMR鑒定出的小麥和大曲中的差異代謝物

注:通過PLS-DA篩選差異物質,顯示了VIP > 1的糖類,、酸類,、氨基酸及其衍生物、醇類和其他物質


3.6 微生物和代謝物的相關性分析


進一步將細菌微生物組和代謝組進行相關性分析,,可以更直觀地預測并理解微生物與代謝物的相關性,,如圖6-1所示。葡萄球菌屬(Staphylococcus)和泛菌屬(Pantoea)與果糖產量呈正相關,,與焦谷氨酸產量呈負相關,,葡萄球菌屬還與一些non-VOCs如蘇糖酸鹽和檸康酸鹽呈負相關作用,而泛菌屬與一些VOCs呈負相關,,如1-辛烯-3-酮,、2-甲基丁醛和苯乙醛。嗜熱放線菌屬(Thermoactinomyces)與果糖含量有負相關作用,,對甘露醇,、赤蘚糖醇、琥珀酸,、焦谷氨酸和檸康酸有正向促進作用,,嗜熱放線菌屬可以分泌蛋白酶、淀粉酶,、纖維素酶,、葡萄糖淀粉酶等水解蛋白質和淀粉,代謝產生VOCs[118],。糖多孢菌屬(Saccharopolyspora)與一些VOCs包括1-辛烯-3-酮,、2-甲基丁醛二聚體、3-甲基丁醛二聚體和苯乙醛單體之間存在正相關關系,。整體來看,,嗜熱放線菌屬和葡萄球菌屬與大部分non-VOCs的相關性趨勢相反,而泛菌屬(Pantoea)和糖多孢菌屬(Saccharopolyspora)與VOCs的相關性相反,。

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圖6-1 Spearman秩相關檢驗的微生物與代謝物相關性熱圖

a:細菌和非揮發(fā)性有機物,;b:細菌和揮發(fā)性有機化合物;c:真菌和非揮發(fā)性有機物,;d:真菌和揮發(fā)性有機化合物,。上述微生物為細菌/真菌相對豐度排名前10的菌屬,代謝產物為通過PLS-DA模型篩選的組間有顯著差異的揮發(fā)性物質和非揮發(fā)性物質(*表示P < 0.05;**表示P < 0.01)


對于真菌和代謝物相關性作用,,熱圖結果顯示嗜熱子囊菌屬(Thermoascus)與眾多代謝物呈正相關作用,,其中包括3種醇(甘露醇、赤蘚糖醇和阿拉伯糖醇),、3種醛(2-甲基丁醛二聚體,、3-甲基丁醛二聚體和苯乙醛單體)、3種酸(甲酸鹽,、葡萄糖酸鹽和琥珀酸鹽)和2種氨基酸衍生物(焦谷氨酸鹽和谷氨酰胺),。Chromocleista與乳酸和亮氨酸呈強正相關作用(相關性系數絕對值大于0.8),Alternaria和Mycosphaerella與一些氨基酸(脯氨酸和精氨酸)及其衍生物(焦谷氨酸和4-羧基谷氨酸)呈顯著負相關,,而與果糖含量呈正相關,。圖d可以看出Alternaria和Mycosphaerella與大多數差異性的VOCs展示出了相似的相關性作用,尤其是1-辛烯-3-酮單體,、2-甲基-丁醛和3-甲基丁醛二聚體,、甲基丙醛、苯乙醛單體和丙醛,。Millerozyma被預測與葡萄糖,、乳酸、乙酸,、亮氨酸和纈氨酸呈正相關,,Rhizomucor和Lichtheimia的豐度與乙酸鹽呈正相關,Alternaria,、Mycosphaerella和Aspergillus這三個真菌屬與代謝產物的相關性趨勢相似,,而Thermoascus與它們的相關性趨勢幾乎相反。


細菌和真菌豐度優(yōu)勢菌屬和代謝物的相關性分析表明高溫放線菌屬和葡萄球菌屬與大多數非揮發(fā)性代謝物的相關性趨勢相反,,而泛菌屬和糖多孢菌屬與揮發(fā)性代謝物的相關性作用相反,。鏈格孢菌屬、小球殼菌屬和曲霉菌屬與代謝產物的相關性趨勢相似,,而嗜熱子囊菌屬與它們的相關性趨勢幾乎相反,。以上關聯(lián)網絡分析全面展示了大曲培菌過程中多組學之間的關聯(lián)性,為后續(xù)菌群的功能驗證提供了思路和方向,。


3.7模擬培菌解析小麥源菌群的代謝特征


本部分研究是在實驗室水平下,,模擬車間高溫大曲的制曲培菌過程,設置相同的培菌溫度,,以是否將小麥源微生物進行滅菌處理為變量,,比較對照組和實驗組培菌過程中可培養(yǎng)微生物數量、群落演替,、代謝物積累和代謝通路表達的差異,,全面直觀地闡述小麥源微生物在培菌過程中的功能作用,,并篩選其中發(fā)揮最關鍵功能的小麥源核心菌屬,發(fā)掘核心微生物的代謝功能,,旨在從控制微生物的角度優(yōu)選原料,,調節(jié)和優(yōu)化高溫大曲培菌過程。


對兩組模擬培菌的大曲樣品的可培養(yǎng)微生物數量進行統(tǒng)計分析,,結果顯示,,在模擬培菌初期,不做任何處理(MOE)組的需氧菌落總數顯著高于滅酶滅菌(MOE_inactivate)組,,耐熱菌生物量也呈現(xiàn)了相似的趨勢,。從培菌第7天到結束,MOE和MOE_inactivate組中的可培養(yǎng)真菌數量都低于有效計數范圍,。在相同的培菌溫度下,實驗室水平的模擬培菌可以獲得數量可觀的可培養(yǎng)細菌,,但真菌數量處于很低水平,,因此我們認為小麥源細菌在培菌過程中可能起著更重要的作用,而真菌更可能來自制曲車間環(huán)境,。綜上,,小麥源細菌應該得到更多重視。進一步對兩個實驗組的微生物組和代謝物進行解析和相關性分析,,高通量測序結果表明兩個培菌過程的細菌多樣性和群落結構都有明顯差異,,MOE組細菌的多樣性更高,群落組成更豐富,,兩組中豐度最高的細菌均為芽孢桿菌屬,。1H NMR結合多元統(tǒng)計分析篩選出的兩組間的差異代謝物在MOE組中含量更高,尤其是糖類和氨基酸類,,這些物質主要在培菌的前4天快速積累,,小麥源細菌在溫度驅動下參與了這一階段菌群的劇烈演替和活躍的代謝活動。


在以上結果基礎上,,本研究繼續(xù)從微生物多樣性的角度探討了兩組培菌特征差異的原因,。使用細菌序列豐度前100的ASV構建了系統(tǒng)發(fā)育樹以分析細菌群落中的進化關系,,,50%左右的ASV注釋為Bacillus,,且Bacillus在MOE_inactivate和MOE組的分布存在差異性。這一結果佐證了Bacillus的異質性是導致兩組培菌微生物群落演替和代謝差異的關鍵因素,。此外,,結合培菌前期糖類和氨基酸類的快速積累這一特征,下一步以Bacillus菌屬為關鍵研究對象,,小麥源微生物參與的糖和氨基酸代謝為關鍵代謝過程進行更深入的討論,。


MOE_inactivate組和MOE組通過PLS-DA模型的VIP值篩選的差異代謝物的代謝通路富集和功能預測情況如圖7-1所示,,差異代謝物與氨酰tRNA生物合成,D-谷氨酰胺和D-谷氨酸鹽代謝,,纈氨酸,、亮氨酸和異亮氨酸生物合成,氮代謝,,半乳糖代謝,,丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸鹽代謝,,纈氨酸,、亮氨酸和異亮氨酸降解,精氨酸生物合成等顯著相關,。根據通路的富集情況,,氨基酸類和糖類相關的代謝對不同培菌組的培菌特征差異有重要影響,因此進一步詳細展示了纈氨酸,、亮氨酸,、異亮氨酸生物合成,半乳糖代謝,,丙氨酸,、天冬氨酸、谷氨酸代謝,,纈氨酸,、亮氨酸、異亮氨酸降解,,精氨酸生物合成,,淀粉和蔗糖代謝6條重要代謝途徑如b圖所示。代謝途徑中的差異代謝產物包括氨基酸和糖分別用藍色和紅色字體標記,,MOE組的L-異亮氨酸,、L-纈氨酸、L-亮氨酸,、谷氨酰胺,、D-甘露糖、α-D-葡萄糖-1P,、D-葡萄糖含量均高于MOE_inactivate組,,這些物質多在培菌早期快速積累。


在明確了差異菌屬和差異代謝通路之后,,本研究繼續(xù)探索了Bacillus和糖代謝,、氨基酸代謝之間的關聯(lián)性。通過PICRUSt2預測了模擬培菌過程中Bacillus的基因組功能,,選擇所有注釋到Bacillus的ASV進行糖和氨基酸代謝相關的功能預測,,并通過微生物的功能豐度和差異倍數展示差異性(圖7-2),。總體而言,,培菌結束時MOE組Bacillus的糖和氨基酸代謝相關的代謝通路豐度高于MOE_inactivate組,,涉及到的氨基酸代謝通路有14個,糖代謝通路有15個,,其中差異倍數最大的通路分別是組氨酸代謝和磷酸肌醇代謝,。


圖片23.png

圖7-1 高溫大曲模擬培菌過程中代謝產物功能分析

a:代謝通路富集概況氣泡圖;b:關鍵的差異代謝途徑和涉及到的差異代謝物(糖類和氨基酸類)


圖片24.png

圖7-2 Bacillus在MOE_inactivate和MOE培菌組中的功能預測

a:模擬培菌結束時Bacillus的糖代謝和氨基酸代謝的功能豐度,;b:組氨酸和磷酸肌醇代謝相關的酶功能注釋的相對豐度熱圖,;c:酶注釋的序列16S rRNA基因拷貝數的單因素方差分析比較,*代表P < 0.05


小麥源微生物影響高溫大曲菌群的組裝尤其在培菌早期階段,,提供了豐富的代謝物和風味前體物質調控群落演替,,以前的研究已表明大曲中的細菌主要來源于原料,真菌來源于制曲環(huán)境,。在本研究中,,我們分別使用滅菌的小麥(MOE_inactivate)和未作處理的小麥(MOE)分別進行模擬培菌,同時檢測培菌過程中兩組微生物和代謝物譜的差異,。可培養(yǎng)微生物計數結果表明小麥在培菌初期提供了更多細菌,,隨著培菌的進行,,小麥源細菌發(fā)揮了更明顯的作用,這和以前的結果一致,。培菌過程中,,Bacillus是兩組中的豐度最高的優(yōu)勢細菌,通過構建系統(tǒng)發(fā)育樹表明Bacillus的異質性是菌群差異性的集中體現(xiàn),。


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成果表達


4.1 已發(fā)表文章


ü Zhang Y D, Shen Y, Cheng W, Wang X, Xue Y S, Chen X X, Han B Z. Understanding the shifts of microbial community and metabolite profile from wheat to mature Daqu[J]. Frontiers in Microbiology, 2021, 12: 714726.


ü Zhang Y D, Xu J G, Ding F, Deng W Y, Wang X, Xue Y S, Chen X X, Han B Z. Multidimensional profiling indicates the shifts and functionality of wheat-origin microbiota during high-temperature Daqu incubation[J]. Food Research International, 2022, 156: 111191.6


ü Zhang Y D, Xu J G, Jiang Y L, Niu J, Chen X X, Han B Z. Microbial characteristics and metabolite profiles of high-temperature Daqu in different maturation stages[J]. World Journal of Microbiology & Biotechnology, 2022, 38(12): 234.

ü Zhang Y D, Shen Y, Niu J, Ding F, Ren Y, Chen X X, Han B Z. Bacteria‐induced amino acid metabolism involved in appearance characteristics of high‐temperature Daqu[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2022, 103(1): 243-254.


ü Zhang Y D, Ding F, Shen Y, Cheng W, Xue Y S, Han B Z, Chen X X. Characteristics of the microbiota and metabolic profile of high-temperature Daqu with different grades. World Journal of Microbiology & Biotechnology, 2022, 38(8), 137.


ü 張原頔, 沈毅, 程偉, 薛巖松, 陳小雪, 韓北忠. 三代全長高通量測序分析新稻草和陳稻草的微生物特征[J]. 中國釀造, 2022, 41(09): 24-30.


ü 張原頔, 陳小雪, 吳鵬, 史利霞, 韓北忠. 多組學分析眾麥1號和糯麥116兩種制曲小麥的特征[J]. 中國釀造, 2023, 42(02): 32-39.

ü 丁芳, 張原頔, 蔣英麗, 陳波, 陳小雪, 韓北忠. 不同等級高溫大曲微生物群落和代謝物的特征分析[J]. 中國釀造, 2022, 41(11): 24-30.


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行業(yè)效益與人才培養(yǎng)


目前白酒行業(yè)內普遍存在大曲品質不穩(wěn)定的問題,。已有研究表明制曲原料對大曲的品質有重要影響,小麥源微生物對高溫大曲菌群有重要貢獻,,因此從原料微生物的角度著手,,揭示原料微生物在發(fā)酵過程中的遷移規(guī)律和作用機制,有利于對大曲微生物菌群的形成進行干預,,從而提高大曲品質,,在此基礎上,錨定制曲過程中的核心功能微生物菌群,,用標準化的手段來規(guī)范傳統(tǒng)工藝,,保證白酒的產量和質量,也為固態(tài)發(fā)酵過程由“經驗型”控制向“科技型”控制轉變奠定了基礎,。


共培養(yǎng)博士研究生1名和碩士研究生2名,。


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下一步研究計劃


強化接種是驗證功能菌株特性的有效手段,,已有很多研究通過篩選菌株和強化接種來調節(jié)發(fā)酵系統(tǒng)中微生物群落的代謝活動,達到改良發(fā)酵產品的風味的目的,。下一步研究的主要內容是分離,、純化和鑒定小麥源芽孢桿菌菌株,通過環(huán)境耐受性測試和產酶活力篩選發(fā)酵性能優(yōu)良的部分進行強化接種實驗,,通過1H NMR,、LC-MS和氨基酸分析儀檢測了功能菌株單獨培養(yǎng)時發(fā)酵液中和強化大曲樣品中的糖和氨基酸物質的含量,表征功能菌株參與糖代謝和氨基酸代謝的特征,,同時通過擴增子測序和生信分析展示了強化接種對大曲菌群的擾動作用,,最后通過多組學聯(lián)合分析闡明了菌株參與的關鍵代謝通路。

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